Découverte du premier inhibiteur puissant et sélectif de la protéine associée au centromère E: GSK923295

Découverte du premier inhibiteur puissant et sélectif de la protéine associée au centromère E: GSK923295

Les kinésines sont une superfamille de protéines motrices qui utilisent l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP Les kinésines mitotiques sont une classe fonctionnelle des kinésines essentielles à l’assemblage du fuseau mitotique et au fonctionnement pendant la division cellulaire.4,5 La perturbation de l’activité de la kinésine mitotique entraîne l’arrêt du cycle cellulaire dans la mitose et la mort cellulaire subséquente .6 La dernière décennie a suscité un intérêt accru pour le développement d’inhibiteurs à petites molécules des kinésines mitotiques en tant que nouvelle génération d’agents antimitotiques.7 − 10 Étant donné que ces agents ciblent spécifiquement les cellules en division, les inhibiteurs mitotiques de la kinésine ont le potentiel les avantages thérapeutiques des agents antimicrotubules (MT), tels que les taxanes, tout en minimisant les toxicités sur les cellules non divisant, de ce fait Les inhibiteurs de kinésine mitotique les plus avancés dans le développement clinique ciblent la protéine de fuseau de kinésine (KSP ou HsEg5), une kinésine mitotique nécessaire pour la séparation des fuseaux du fuseau pendant la prométaphase.7 − 13 Centromère- la protéine E associée (CENP-E) est une kinésine mitotique directement impliquée dans le couplage de la mécanique de la mitose avec la machinerie de signalisation de point de contrôle mitotique, régulant la transition du cycle cellulaire de la métaphase à l’anaphase.14 − 17 Pendant la mitose, CENP-E est localisée dans la région des chromosomes mitotiques responsable de l’interaction avec les microtubules fusiformes et elle est essentielle pour les mouvements chromosomiques prométaphases qui contribuent à l’alignement des chromosomes en métaphase. Perturbation de la fonction CENP-E en utilisant une variété de méthodes, y compris la microinjection d’anticorps et l’ablation de l’expression génique avec siRNA, induit un arrêt mitotique et un phénotype cellulaire caractérisé par des chromosomes désalignés disposés sur des fuseaux bipolaires, et conduit à la mort cellulaire subséquente.18 − 23Depuis un criblage à haut débit d’une bibliothèque de petites molécules de 700K membres recherchant des inhibiteurs de l’activité ATPase stimulée par les microtubules de CENP-E, nous avons identifié un fragment de bas poids moléculaire (acide benzoïque 2, Figure ​ ) 1) avec une IC50 biochimique de 6,7 μ M et aucun effet cellulaire détectable à 40 μ M. Bien que nous étions incapables de poursuivre une approche d’optimisation basée sur un fragment typique en utilisant la cristallographie aux rayons X ou RMN, 24 la bonne efficacité de liaison ligand25,26 (Δ G / nombre d’atomes non hydrogène, LE = 0,50), sélectivité vs autres les kinésines, et les caractéristiques structurelles susceptibles de créer rapidement des analogues ont constitué un point de départ intéressant pour une optimisation ultérieure. Raisonnant que l’absence d’activité cellulaire pourrait être due à la faible perméabilité liée à la présence du carboxylate, une petite banque d’analogues d’amides a été préparée en couplant 2 avec un ensemble de dérivés d’acides aminés portant une variété de chaînes latérales et différents C-. Des exemples représentatifs sont montrés dans le tableau 1. Les composés 3g et 3h, qui contiennent une chaîne latérale de groupe benzyle et une extrémité C-terminale primaire ou méthyl-amide, ont des valeurs de CI50 similaires à celles de la sélection 2. La glycine simple l’analogue d’amide (3a) était inactif, tout comme les analogues avec des chaînes latérales contenant une chaîne alkyle simple (3b), des donneurs ou des accepteurs de liaison H (3c et 3d) ou des homologues du groupe benzyle (3e et 3f). Un amide tertiaire (3i) et un ester méthylique (3j) à l’extrémité C-terminale rendent également les composés inactifs. L’analogue de l’acide carboxylique 3k a conservé une certaine activité mais était 10 fois moins actif que 3g. Figure 1 Structures de 1 et 2.Tableau 1Biochimie des analogues de benzamideAvec l’identification du phénylalaninamide comme nouvel échafaudage actif, nous avons exploré la substitution sur la chaîne latérale phényle groupe d’introduire davantage de diversité structurelle. Un scan Topliss systématique28 a révélé que la substitution était tolérée à peu près également à toutes les positions avec des groupes électro-attracteurs ou donneurs d’électrons (4a − 4f) comme le montre le tableau 2. La substitution avec un groupe phényle plus grand était considérablement plus sensible. Un cycle phényle ajouté à la position 4 (4g) a amélioré la puissance biochimique de 10 fois tandis que la même substitution aux positions 2 et 3 (4h et 4i) a considérablement atténué la puissance. De façon encourageante, 4g a également montré le premier signe d’effet antiprolifératif dans la lignée cellulaire de carcinome ovarien humain SKOV-3 avec une CI50 de 6,2 μ À la lumière de ces résultats, nous avons étudié la substitution hétérocyclique en position 4 du cycle phényle comme un moyen d’optimiser les propriétés physicochimiques tout en améliorant l’activité biochimique et cellulaire. Un groupe imidazolyle lié par l’intermédiaire de la position 2 ou 4 s’est avéré être le plus actif parmi une variété d’hétérocycles à cinq et six membres explorés.En passant d’un substituant méthyle modérément puissant (4j) à un groupement tert-butyle volumineux (4k et 4l) ou à une fusion avec un noyau phényle (ie, benzimidazolyle, 4m), les activités biochimiques et cellulaires ont été encore améliorées.Tableau 2 Activité biologique de la phénylalanine Amide AnaloguesAvec un composé puissant (4m) dans la main, nous avons examiné s’il y avait une préférence stéréochimique pour la liaison à CENP-E. Les deux (S) – et (R) énantiomères de 4 m ont été synthétisés en utilisant des matériaux de départ énantiomériquement purs, et la pureté chirale finale était > 98% ee par HPLC chirale pour chaque antipode. Comme le montre le tableau 3, le (S) -énantiomère (5a) est > 400 fois plus puissant que l’énantiomère (R) (5b), ce qui montre une tendance prononcée à stéréochimique la poche de liaison pour la (S) – antipode. Cette stéréosélectivité se traduisait bien dans l’activité cellulaire puisque les cellules traitées avec 5a présentaient le phénotype d’arrêt mitotique caractéristique (fuseaux bipolaires avec chromosomes mal alignés), alors que 5b ne présentait aucun effet, fournissant un support important pour un mécanisme cible d’inhibition de la prolifération cellulaire basé sur l’inhibition. Bien que la CI50 biochimique ait été grandement améliorée par l’incorporation d’un groupe biaryle dans la chaîne latérale, l’activité cellulaire de ces composés était encore 100 fois inférieure à leur activité biochimique. Nos efforts se sont déplacés vers la modification de l’extrémité C-terminale dans une tentative de réduire ce différentiel. La réduction des groupes C-terminaux, tels que hydroxyméthyle (6a et 6b), aminométhyle (6c) et aminoéthyle (6e) ont donné des améliorations modestes à la fois l’activité biochimique et cellulaire (tableau 4). Remarquablement, cependant, une extension d’un carbone à un groupe hydroxyéthyle (6d) a significativement amélioré la puissance cellulaire (SKOV-3 IC50 = 94 nM), avec seulement une amélioration modeste de l’activité biochimique. Les études mécanistiques détaillées de 6d et 4g ont révélé qu’il y avait une différence significative dans leurs modes d’inhibition. Des études cinétiques à l’état d’équilibre ont montré que 6d n’était pas compétitif avec l’ATP, alors que 4g était compétitif pour l’ATP. Puisque la concentration d’ATP dans les cellules est beaucoup plus élevée que celle utilisée dans le test biochimique (500 μ M), cela pourrait aider à expliquer la disparité entre les activités biochimiques et cellulaires pour les inhibiteurs compétitifs de l’ATP tels que 4g.Table 4Effect of C -Terminal Modification sur l’activité biologiqueNous postulons que 4g et 6d interagissent avec l’enzyme dans une fente de liaison allostérique adjacente au site de liaison ATP et que la modification structurelle relativement mineure perturbe la poche ATP de telle sorte qu’un changement dans la modalité d’inhibiteur est observé viagra générique. surtout, l’activité cellulaire améliorée avéré être général avec l’incorporation de l’hydroxyéthylcellulose dans le modèle d’inhibiteur et alimenté en outre exploration.Maintaining le groupement hydroxyéthyle, nous avons exploré en outre la substitution du groupe phényle de la chaîne latérale. La transposition de l’un des azotés d’imidazole pour donner l’imidazole isomère 7 n’a montré aucun avantage. Cependant, le fait de contraindre les groupes méthyle et tert-butyle à former un cycle imidazopyridine (8a) a entraîné une augmentation significative de l’activité biochimique et cellulaire (tableau 5). Malheureusement, 8a était beaucoup moins soluble30, et puisque notre objectif était d’identifier un médicament qui pourrait être administré par voie intraveineuse, maximiser la solubilité aqueuse était crucial. De façon encourageante, l’addition d’un groupe hydroxyle (8b) à la chaîne latérale de l’imidazopyridine a rétabli la solubilité sans atténuation de la puissance biochimique et cellulaire.31 Tableau 5 Activité biologique de certains analogues d’imidazopyridine Bien que des gains significatifs en enzyme et en activité cellulaire aient été obtenus, la pharmacocinétique chez le rat ( PK) de ces analogues ont été caractérisés par des clairances élevées et des demi-vies courtes. Dans une tentative de rationalisation de la PK sous-jacente pauvre, le métabolisme in vitro d’analogues sélectionnés dans les hépatocytes et les microsomes de rats et humains a été étudié. Les résultats indiquent que l’hydroxylation de la chaîne latérale biaryle et l’oxydation du groupe hydroxyle primaire ont été les voies métaboliques les plus répandus, et les dérivés qui ont incorporé les modifications susceptibles de réduire ou de bloquer ces sites métaboliques putatifs ont été targeted.Modification de la chaîne latérale, y compris l’incorporation d’atomes de fluor dans différentes positions sur les groupes aryle de la chaîne latérale, a eu peu d’effet sur PK.32 Nous avons ensuite examiné les alternatives au groupe hydroxyéthyle C-terminale, en gardant à l’esprit que le maintien du mécanisme de l’ATP non compétitif de l’inhibition serait nécessaire pour la rétention de bonne activité cellulaire. Bien que divers groupes cycliques et acycliques aient maintenu des niveaux élevés de puissance enzymatique et cellulaire, les glycinamides substitués ont également fourni une augmentation modérée de l’exposition couplée à une solubilité significativement améliorée. Ces efforts ont finalement mené à l’identification de GSK923295 (1), un inhibiteur puissant du CENP-E humain.

Ochoa et al. rapportent que les déplétions sérotonergiques post-entraînement de l’amygdale basolatérale n’ont pas perturbé la discrimination, la rétention ou l’apprentissage par inversion; suggérant que cette activité sérotoninergique n’est pas requise pour la formation et l’ajustement flexible de nouvelles associations stimulus-récompense lorsque la stratégie pour résoudre efficacement la tâche a déjà été apprise. Hern á ndez-P é rez et al. rapportent que la réduction de la sérotonine dans le noyau supramammillaire modifie l’apprentissage de la place et l’activité thêta concomitante de l’hippocampe, du septum et du supramammillaire dans la mémoire spatiale. Zhang et Stackman passent en revue les progrès de la distribution, de la signalisation, de la polymérisation et de la modulation allostérique des récepteurs 5-HT2A; ainsi que des fonctions dans l’apprentissage et la mémoire, l’hallucination et la cognition spatiale, et les troubles mentaux. Pereira et al. nous montrer que l’agonisme des récepteurs 5-HT6 facilite l’apprentissage émotionnel et implique le cortex préfrontal et la signalisation de l’hippocampe. La fonction de transporteur sérotoninergique est rapportée par Sivamaruthi et al. démontrant que l’infection à Cronobacter sakazakii modifie le transporteur de la sérotonine et améliore la rétention de la mémoire de la peur. Stiedl et al. discuter du rôle des sous-types de récepteurs sérotoninergiques 5-HT1A et 5-HT7 et de leur interaction dans l’apprentissage émotionnel et la mémoire; y compris le rôle de ces récepteurs et leur interaction au niveau moléculaire, neurochimique et comportemental. L’implication potentielle des marqueurs neuronaux sérotoninergiques par rapport à la mémoire est passée en revue par Meneses. Mention spéciale et grâce au travail d’expert des arbitres, qui ont fait des revues professionnelles et soigneuses qui ont amélioré les articles sur ce sujet.