Epidémiologie moléculaire des foyers de gastroentérite virale dans l’Etat de New York, –

Epidémiologie moléculaire des foyers de gastroentérite virale dans l’Etat de New York, –

Cette étude a évalué le rôle du virus de type Norwalk NLV et d’autres virus tels que le rotavirus, l’adénovirus entérique et l’entérovirus dans les épidémies de gastro-entérite aiguë non bactérienne survenues en plusieurs mois en l’espace de plusieurs mois dans l’Etat de New York collagène. les échantillons de selles ont été analysés avec une combinaison de RT-PCR et de séquençage nucléotidique, de culture cellulaire et de techniques de diagnostic ELISA. La NLV a été détectée dans tous ces foyers, avec un taux de détection global de% pour tous les échantillons testés. tentatives d’isoler d’autres pathogènes viraux ont échoué L’analyse phylogénétique d’un sous-ensemble de spécimens de ces foyers a montré la présence de NLV de génogroupe I et de génogroupe II Un spectre de séquences nucléotidiques différentes a été détecté, démontrant une variation de séquence et des infections non apparentées. agent de flambées de diarrhée à New York St a mangé

Virus de type Norwalk Les virus de la nécrose hématopoïétique, appelés précédemment calicivirus humain, famille de virus Norwalk ou petit virus à structure ronde SRSV, sont un genre de la famille des Caliciviridae Le virus contient un seul génome d’ARN à brin positif de longueur et Une seule protéine de capside de ~ kDa en poids L’étude de ces virus a été limitée car ils ne peuvent être cultivés en culture tissulaire ni propagés dans un modèle animal. Détermination de la séquence génomique complète du virus prototype Norwalk et du virus Southampton et l’analyse des réponses immunitaires des patients infectés aux antigènes des protéines virales recombinantes ont facilité la caractérisation phylogénétique de souches supplémentaires de VNR . Par conséquent, ces virus peuvent maintenant être différenciés en génogroupes majeurs: génogroupe I, qui contient le virus Norwalk et Le virus de Southampton et le génogroupe II, qui contient le virus d’Hawaii, le virus de Camberwell et les virus de la montagne Snow ont été reconnus comme les plus La maladie est transmise par des aliments ou de l’eau contaminés, directement par contact de personne à personne, ainsi que par des gouttelettes en suspension dans l’air produites pendant les vomissements. Selon la cause virale commune des épidémies de gastro-entérite aiguë d’origine alimentaire et hydrique. Selon une estimation récente, environ un million de personnes développent la maladie chaque année aux États-Unis Bien que l’épidémiologie et les facteurs de risque de la maladie du VLN deviennent plus clairs, l’importance de la santé publique des VNL en tant que causes de gastro-entérite épidémique et sporadique chez les adultes au niveau local ou national Cette question devient encore plus importante pour les localités qui accueillent régulièrement de nombreuses activités récréatives importantes, comme les camps d’été et les stations de ski et / ou abritent de nombreuses maisons de soins infirmiers et autres établissements de soins aux personnes âgées. dans les Centres de contrôle et de prévention des maladies CDC Réseau de surveillance active des maladies d’origine alimentaire FoodNet An importan Ainsi, la prise de conscience accrue des VNL en tant que causes de gastro-entérite épidémique et la disponibilité de meilleures méthodes de détection du virus nous ont amenés à mettre en œuvre des tests viraux plus étendus pour les maladies non bactériennes. calicivirus, rotavirus, adénovirus entérique et entérovirus, en utilisant une combinaison de RT-PCR, de culture cellulaire et de techniques ELISA pour déterminer l’étiologie des maladies causées par des éclosions de gastro-entérite pour lesquelles les tests microbiologiques ont été négatifs pour les agents pathogènes bactériens des épidémies de gastro-entérite dans l’État de New York Bien que FoodNet soit actif dans certains comtés de New York, nous avons examiné les éclosions à l’échelle de l’État afin d’avoir une base de données plus vaste. éclosions dans tout l’État de janvier à juin Dans ce rapport, nous présentons des données provenant de ces éclosions, sélectionnées au hasard, qui ont été étudiées de janvier à juillet.

Méthodes

Les flambées Entre janvier et juillet, une tentative a été faite pour recueillir des échantillons de selles pour l’analyse virale de foyers de gastro-entérite dans l’État de New York qui étaient de taille relativement grande, à savoir, & gt; L’étude a été menée conformément aux lignes directrices pour la recherche humaine spécifiées par le Département américain de la Santé et des Services humains. Spécimens Un échantillon représentatif de ~% de spécimens de selles provenant de% des foyers dans tout l’état ont été Trois des foyers sont survenus dans les comtés de Rensselaer, Glendale et Greene qui sont des zones de surveillance de FoodNet également connues sous le nom de «sites FoodNet». Les spécimens, qui ont été déclarés exempts de bactéries pathogènes par les chercheurs locaux, ont été congelés à Cultures en culture conventionnelle Des cultures conventionnelles en tube de rein de singe vert africain, de poumon humain embryonnaire HEL, de rhabdomyosarcome humain RD et de cellules A ont été inoculées avec un% de suspension de chaque échantillon de selles préparé en% de gélatine-Tris Hanks solution contenant de la pénicilline U / mL et de la streptomycine μg / mL. Les milieux utilisés ont été préparés à l’interne par la cellule C Section de la préparation des médias et des médias du Wadsworth Center Département de la santé de l’État de New York En bref, des cultures confluentes ont été inoculées avec ml de suspension de selles par tube et incubées à ° C pour h. Ensuite, l’inoculum a été retiré Le milieu essentiel minimum d’Eagle [EMEM] avec de l’Hepes mmol qui contenait les antibiotiques, U / ml de fungizone et du sérum fœtal bovin, pour les cellules A et RD; ou, pour les cellules HEL ou EMEM,% de sérum avec% de bouillon de tryptose phosphate qui contenait les antibiotiques et de fungizone pour les cellules de singe Les cultures inoculées ont été vérifiées fréquemment toutes les heures pour des effets cytopathiques. Sanofi Diagnostics a été utilisé pour détecter le rotavirus dans les échantillons de selles. Excrétion d’ARNH Les homogénats de selles dans une concentration d’eau distillée stérile,% -% ont été mélangés en vortexant avec un volume égal de trichloro-trifluoroéthane Fréon et clarifiés par centrifugation pendant min à L’ARN du surnageant aqueux a été extrait à l’aide du système d’isotomie d’ARN Ultraspec. Biotecx LaboratoriesRT-PCR amorces Deux séries d’amorces ont été utilisées Les amorces fixées, désignées « DG » ou « Région B » et fournies par la section Gastroentérite virale des centres pour le contrôle et la prévention des maladies Atlanta, GA, étaient comme suit: MON ‘-TGGACIAGRGGICCYAAYCA-‘, MON ‘-TGGACICGYGGICCYAAYCA-‘, MON ‘-GAAYCTCATCCAYCTGAACAT-‘, et MON ‘-GAASCGCATCCARCGGAACAT-‘ MON et MON ont été utilisés pour la synthèse inverse de l’ADNc , et MON et MON ont été utilisés pour la synthèse en avant La taille de l’amplicon était bp Les amorces définies, désignées par « -« , étaient, avec la séquence « -GTTGACACAATCTCATCATC-« , et, avec t La séquence ‘-GCACCATCTGAGATGGATGT-‘ La taille de l’amplicon était bp Ces amorces ont été conçues pour détecter à la fois les NLVs de génogroupe I et de génogroupe II pour RT-PCR. La transcription inverse dépendant de l’amorce DG et la PCR ont été effectuées séquentiellement dans un seul tube réactionnel. ailleurs En bref, l’ARN a été mis en suspension dans un tampon μL contenant mmol de Tris-HCl pH, mmol de KCl; mmol MgCl; % vol / vol Triton-X; mmol de dithiothréitol; mmol de mercaptoéthanol; U de l’inhibiteur de la RNase du placenta humain Boehringer; mmol chacun de «désoxyadénosine-triphosphate, de désoxycytidine-triphosphate, de désoxyguanosine-triphosphate et de désoxythymidine-triphosphate; umol de chacune des amorces MON, MON, MON et MON; U du virus de la myéloblastose aviaire super-transcriptase inverse Ressources génétiques moléculaires; et U de AmpliTaq DNA polymerase Applied Biosystems Le format thermocyclique de l’incubation était le cycle de RT à ° C pendant h, le cycle de dénaturation à ° C pendant min; cycles d’amplification avec dénaturation à ° C pendant min, recuit à ° C pendant min s, extension à ° C pour min, et un cycle final d’incubation à ° C pendant min Les produits d’amplification ont été analysés par électrophorèse en gel d’agarose% et visualisés sous Éclairement UV après coloration avec μg / mL de bromure d’éthidium Les conditions pour la RT-PCR dépendante ont été décrites ailleurs Séquençage nucléotidique L’ADNc du produit -bp ou -bp a été excisé du gel, extrait et purifié à l’aide du kit Qiagen et soumis à un séquençage de nucléotides automatisé ABI Prism; Les séquences nucléotidiques et les séquences d’acides aminés déduites de Perkin-Elmer Biosystems ont été analysées à l’aide du logiciel de l’Université du Wisconsin Genetics Computer Group

Résultats

Onze foyers de gastro-entérite à partir desquels des spécimens étaient disponibles ont été observés à New York en l’espace de quelques mois. Janvier-juillet Tableau Ces épidémies variaient entre les cas de maladie médiane, les cas Les foyers étaient éparpillés dans tout l’état et la période, sans schéma saisonnier clair Différents milieux étaient impliqués: les foyers étaient associés aux maisons de soins infirmiers, aux camps d’été, aux établissements de restauration, à une institution et à une station de ski Le mode de transmission suspecté était de personne à personne dans les éclosions d’origine alimentaire dans, et inconnu dans Les échantillons qui ont été testés provenaient de patients âgés de – ans médiane, années; Le nombre de femmes était féminin La période d’incubation variait de h à h médiane, et la durée de la maladie allait de à h La nausée était un symptôme important, avec des vomissements, des diarrhées non sanglantes, de la fièvre et des frissons; d’autres symptômes – crampes abdominales et maux de tête – étaient moins fréquents

Vue de la table grandTélécharger la diapositive Récapitulatif des foyers de gastro-entérite non bactérienne pour lesquels des échantillons de selles ont été testés pour le virus de type Norwalk NLV par RT-PCR, État de New York, janvier-juillet Tableau Agrandir DiapositiveTéléchargements de foyers de gastroentérite non bactérienne pour lesquels Norwalk a testé des échantillons de selles -like virus NLV par RT-PCR, État de New York, janvier-juillet

Tableau View largeTélécharger la diapositiveDisease symptômes chez les patients de foyers de gastro-entérite non bactérienneTable View largeTélécharger la diapositiveDisease symptômes chez les patients de foyers de gastro-entérite non bactériennesLes laboratoires locaux ont signalé que les échantillons de selles étaient exempts de bactéries pathogènes; les échantillons ont été testés négatifs pour les entérovirus et les sérotypes d’adénovirus entériques, et par culture cellulaire et pour les rotavirus par ELISA dans notre laboratoire Cependant, des échantillons testés positifs pour la NLV par RT-PCR figure Chaque ensemble d’amorces DG – et produit un seul majeur bande de la taille attendue et bp, respectivement; les NLV ont été séquencés dans tous les foyers, avec un taux de détection de% d’échantillons pour tous les échantillons de selles testés. Le nombre de spécimens testés positifs pour chaque foyer variait de% à% moyen,% des échantillons positifs,% testés positifs avec les amorces DG et% testés positifs avec l’ensemble – Les échantillons sélectionnés positifs pour la DG ont également été analysés pour leur réactivité croisée avec la paire – d’amorces, des spécimens des foyers de l’Onondaga, du Gowanda et des foyers de Greene réagi avec les amorces des deux ensembles Ces données limitées démontrent l’efficacité de détection plus élevée du% d’ensemble de DG, comparé au% d’ensemble, et indiquent la grande diversité génétique dans les NLV de ces foyers

Figure Vue largeDownload slideGenetic empreintes de -bp panneau supérieur et -bp panneau inférieur produits RT-PCR dans des gels d’agarose après coloration au bromure d’éthidium d’isolats viraux à partir de spécimens de selles de diverses épidémies de gastro-entérite Panneau supérieur, schémas RT-PCR obtenus avec des amorces DG pour l’ARN des isolats des foyers suivants: voies -, Schuyler; voie, Dutchess; voies -, géorgien; voies et, Dutchess; voies et, Parker; voie, Sullivan B; voie, contrôle de l’eau; voie, marqueur moléculaire -bp Panneau inférieur, profils RT-PCR obtenus avec l’utilisation – d’amorces pour l’ARN d’isolats provenant des foyers suivants: voie, Glendale; Lane, Warren; voies -, Rensselaer; voie, Onondaga; voie, contrôle de l’eau: voies et, marqueur moléculaire -bp; piste, -bp markerFigure View largeTélécharger les empreintes génétiques du panneau supérieur -bp et du panneau inférieur -bp Produits RT-PCR dans des gels d’agarose après coloration au bromure d’éthidium d’isolats viraux provenant d’échantillons de selles provenant de diverses épidémies de gastro-entérite Panneau supérieur, schémas RT-PCR obtenus avec utilisation d’amorces DG pour l’ARN d’isolats provenant des foyers suivants: voies -, Schuyler; voie, Dutchess; voies -, géorgien; voies et, Dutchess; voies et, Parker; voie, Sullivan B; voie, contrôle de l’eau; voie, marqueur moléculaire -bp Panneau inférieur, profils RT-PCR obtenus avec l’utilisation – d’amorces pour l’ARN d’isolats provenant des foyers suivants: voie, Glendale; Lane, Warren; voies -, Rensselaer; voie, Onondaga; voie, contrôle de l’eau: voies et, marqueur moléculaire -bp; Pour étudier davantage cette variabilité génétique, nous avons analysé les amplicons séquencés provenant d’isolats de VNR provenant de ces foyers. La région A -nt vers la fin du cadre de lecture ouvert ORF [,,] a été obtenue avec l’ensemble des amorces des isolats des foyers. et comparées avec les séquences correspondantes des souches de référence Ces souches incluaient le virus Desert Shield groupe génétique GI , le virus Camberwell groupe génétique GII, et la souche NLV NorJD SRSV-OTH – // J groupe génétique GII Le nucléotide Parmi les souches de référence utilisées, le virus de Camberwell était le plus similaire jusqu’à% identité de séquence de nucléotides pour isoler des foyers les foyers de Georgian, Parker, Schuyler et Sullivan, la référence de chaque souche étant différente de celle des souches de référence. La souche NorJD de la NLV était la plus proche de l’isolat de l’identité de l’épidémie de Gowanda, et le virus du Desert Shield était plus proche des isolats de la Dutchess, Dutchess, une Les isolements provenant des foyers Dutchess et Dutchess présentaient des séquences dissemblables L’identité entre les isolats de l’épidémie, c’est-à-dire l’identité interoutbreak, variait de% souche d’éclosion de Dutchess contre les souches Georgian ou Sullivan à% Georgian vs Parker, Schuyler ou Sullivan, alors que les isolats provenant d’une seule éclosion étaient semblables les uns aux autres

Figure Vue large Diapositive montrant la relation de regroupement entre les isolats de calicivirus provenant de poussées de gastro-entérite et les souches de référence Virus de type Norwalk, basé sur les données de séquençage des nucléotides La distance le long de l’axe horizontal est proportionnelle aux différences de nucléotides entre les séquences. progiciel Les majuscules indiquent les souches de référence; le suffixe « con » indique « séquence consensus » Figure Voir grandDownload slideDendrogramme montrant la relation de regroupement entre les isolats de calicivirus provenant d’épidémies de gastro-entérites et les souches de référence virus de type Norwalk, basé sur les données de séquençage des nucléotides. a été généré avec le progiciel de l’Université du Wisconsin Genetics Computer Group Les majuscules indiquent les souches de référence; le suffixe « con » indique « séquence consensus » La région A -nt du gène de l’ARN polymérase virale a été obtenue avec la paire d’amorces d’autres isolats provenant de différents foyers et a été comparée avec les séquences correspondantes du virus de référence Norwalk et Southampton Nous avons de nouveau observé que la séquence de chaque foyer était unique et différait de celle des souches de référence. L’identité de la séquence nucléotidique entre les isolats et le virus de référence variait de% à%, et l’identité interoutbreak était & gt % Souche de l’épidémie de Glendale vs Souches d’Onondaga ou de Warren

Diagramme montrant la relation de regroupement entre les isolats de calicivirus provenant des échantillons de selles et les souches de référence du virus de type Norwalk et du virus de Southampton, basé sur les données de séquençage des nucléotides Le dendrogramme a été généré avec le progiciel de l’University of Wisconsin Genetics Computer Group. souches de référence; le suffixe «con» indique «séquence consensus» Figure Agrandir Diaporama montrant la relation de regroupement entre les isolats de calicivirus provenant des échantillons de selles et les souches de référence du virus de Norwalk et du virus de Southampton, basé sur les données de séquençage des nucléotides Le dendrogramme a été produit avec l’Université du Wisconsin. Progiciel Genetics Computer Group Les majuscules indiquent les souches de référence; le suffixe « con » indique « séquence consensus » Des substitutions nucléotidiques se sont produites au troisième nucléotide des codons dans la plupart des cas que nous avons détectés. Les séquences d’aminoacides déduites des séquences nucléotidiques des produits de PCR amplifiés par DG des isolats sont montrées dans figure A Les isolats des foyers Georgian, Parker, Schuyler et Sullivan présentaient des séquences d’acides aminés identiques et présentaient une identité de séquence% avec le virus de référence de Camberwell; l’isolat de l’épidémie de Gowanda, avec des substitutions d’acides aminés, présentait presque% d’identité de séquence, et les isolats des autres foyers Dutchess, Dutchess et Greene, chacun avec plusieurs substitutions, présentaient des identités de séquence inférieures% -% au virus de référence. Les isolats de ces derniers foyers, Gowanda, Dutchess, Dutchess et Greene, ont montré une diversité inter-coupe, mesurée par le nombre de substitutions d’acides aminés. Parmi les souches de référence utilisées, le virus de Camberwell une identité en% d’acides aminés avec la souche NorJD mais moins d’identité avec le virus Desert Shield

Figure Vue largeTélécharger les séquences d’acides aminés des isolats de la flambée et des calicivirus de référence Seuls les acides aminés différents des acides aminés de référence sont le virus de Camberwell A et le virus de Norwalk BFigurez les acides aminés identiquesFigure calicivirus Seuls les acides aminés qui sont différents des acides aminés de référence sont le virus de Camberwell A et le virus de Norwalk B. Les hyphènes désignent des acides aminés identiques. Les séquences d’aminoacides des autres isolats, déduites des séquences nucléotidiques des produits de PCR obtenus avec le – paire d’amorces, a également montré une certaine diversité et diversité du virus de référence Norwalk Le nombre de substitutions d’acides aminés variait de, dans les isolats des foyers Onondaga et Rensselaer, à plusieurs, dans les isolats d’autres foyers Figure B

Discussion

L’un des objectifs du Département de la Santé de l’Etat de New York et des épidémiologistes étatiques a été de développer la capacité de santé publique à détecter et investiguer rapidement les épidémies de gastro-entérite grâce à des techniques épidémiologiques et de laboratoire sophistiquées. À cette fin, la présente étude est l’une des premières enquêtes à l’échelle de l’État, y compris les sites infectieux émergents pathogènes, Rochester et Albany figure d’une série de flambées successives de gastro-entérite virale qui s’est produite sur une période de plusieurs mois. -PROC, culture cellulaire, et méthodes de diagnostic ELISA ont été utilisés pour déterminer l’étiologie de la maladie par des tests de spécimens de selles bactériennes négatives Dans l’enquête, une attention particulière a été accordée à la détection des sérotypes NLV, entérovirus, rotavirus et adénovirus entériques,, et, qui sont les causes virales les plus fréquemment signalés o f gastro-entérite chez les adultes et les enfants L’enquête a également inclus une analyse de la diversité génétique des VNR recueillis à partir de ces occurrences chronologiquement distinctes, et les résultats ont mis au jour plusieurs modèles distincts

Figure Vue largeTélécharger une carte de l’État de New York montrant les comtés où se sont produits les foyers séquentiels de gastro-entérite virale ressemblant à Norwalk -Figure View largeTélécharger une carte de l’État de New York montrant les comtés où ont eu lieu les éclosions séquentielles de gastro-entérite virale Norwalk Les VNR étaient le seul agent viral identifié par RT-PCR pour toutes les poussées non bactériennes, avec un taux de détection de% d’échantillons pour tous les échantillons de selles testés. Les tentatives d’identifier d’autres pathogènes par culture et d’autres tests dans les spécimens ont échoué à plusieurs reprises. De plus, les caractéristiques cliniques et les symptômes de la maladie, y compris la brève période d’incubation – h et la durée de la maladie – h, et la prévalence élevée de nausées, de vomissements et de diarrhée étaient compatibles avec les caractéristiques de la maladie. ,,,] Le taux de détection variait considérablement entre les éclosions, ce qui pourrait être dû à La contamination des échantillons par les virus, l’état des spécimens, par exemple, les inhibiteurs, et le moment de leur collecte et / ou stockage avant leur transfert sur le site d’essai [,,] Néanmoins, notre enquête confirme que les NLV sont des agents pathogènes importants. De plus, dans ces foyers, le virus s’est propagé par l’intermédiaire d’aliments ou d’eau contaminés et directement d’une personne à l’autre, ce qui est cohérent avec les modes de transmission signalés lors de précédentes épidémies de gastro-entérite [,,] une attention particulière à l’hygiène personnelle des manipulateurs d’aliments et l’adoption d’une politique de travail qui inclurait des congés payés pour les employés souffrant de gastro-entérite, dans divers rassemblements, aideraient à réduire la transmission du VLN. un autre projet CDC de portée différente qui travaille à améliorer la détection virale. Par exemple, des trousses de diagnostic viral et des expéditeurs de spécimens pourraient être Pour suivre l’épidémiologie moléculaire de l’infection, une analyse génétique des empreintes digitales de l’ARN polymérase et de l’extrémité ‘-terminale de la région ORF a été réalisée pour un sous-ensemble de spécimens positifs à la RT-PCR provenant des épidémies; ces séquences ont été amplifiées avec le DG ou les amorces. Nos données ont démontré qu’il y avait une variation de séquence considérable entre les souches appartenant aux génogroupes I et II et que les virus du génogroupe II étaient plus communs que ceux du génogroupe I. ont été détectés dans les virus que nous avons récupérés, et aucun des spécimens ne contenait de séquences identiques à celles des souches de référence. Des différences intéressantes existaient dans la distribution des génotypes de NLV récupérés au fil du temps. Les poussées séquentielles d’avril-mai -le Schuyler, Parker et Les épidémies géorgiennes ont été causées par des virus de type Camberwell avec une grande homologie; il n’y avait que quelques changements de nucléotides dans la séquence du gène de l’ARN polymérase entre les souches de la flambée. Cependant, plus tard dans l’année, des souches de flambées ayant un profil différent ont émergé; Des génotypes regroupant les virus Camberwell et Desert Shield ont été détectés dans les foyers de Sullivan, Greene et Dutchess. Un génotype de type Desert Shield et un génotype de type NorJD, chacun avec quelques changements de nucléotides, ont également été détectés dans les foyers de Gowanda et de Dutchess. de décembre Les épidémies d’origine alimentaire dans le comté de Dutchess, survenues en l’espace de quelques mois, ont montré des séquences différentes, impliquant qu’il y avait des introductions séparées du virus et qu’une seule souche n’a pas provoqué de foyers multiples au cours du temps. Onondaga, Rensselaer, Warren et Glendale de janvier à janvier ont montré que les génotypes se regroupaient avec les NLV. Cette étude limitée montre que plusieurs génotypes de virus ont provoqué les épidémies et suggère que les NLV constituent un problème de santé publique important pour les résidents de tous les âges. des foyers s’est avéré être d’origine virale et, plus spécifiquement, il s’est avéré être causé par les NLV, RT-PCR et d le séquençage moléculaire doit être appliqué pour relier les éclosions avec des souches communes, pour retracer les éclosions aux véhicules infectés et, finalement, pour améliorer les pratiques de santé publique, particulièrement en ce qui concerne les éclosions d’aliments et les manipulateurs d’aliments. des spécimens et des spécimens de personnes asymptomatiques ou de personnes souffrant de diarrhée causée par d’autres pathogènes sont nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes de réplication virale et les sources alimentaires et pour élaborer des mesures préventives globales visant à réduire l’incidence de la gastro-entérite virale