Identification d’un antagoniste du produit naturel contre la protéase de la chaîne légère de la neurotoxine botulique

Identification d’un antagoniste du produit naturel contre la protéase de la chaîne légère de la neurotoxine botulique

Les neurotoxines botuliniques naturelles (BoNT) sont les agents responsables du botulisme, une maladie potentiellement mortelle d’intoxication alimentaire caractérisée par des troubles neuromusculaires périphériques. blocus et paralysie flasque progressive. Sept sérotypes antigéniquement distincts de la neurotoxine (A − G) sont produits et sécrétés par le bacille sporulé Gram positif, anaérobie, Clostridium botulinum, C. butyricum, C. baratii, et C. argentinense.1 BoNTs sont les la plupart des substances vénéneuses connues, le sérotype A ayant une dose létale pour un homme de 70 kg d’environ 0,09 − 0,15 μ g par voie intraveineuse ou intramusculaire et 0,7 − 0,9 μ g par inhalation. toxicité létale, BoNTs sont apparus comme un outil thérapeutique extrêmement précieux pour le traitement d’une variété de maladies, y compris le strabisme, les migraines, et même les rides du visage.3,4 Cependant, l’utilisation potentielle de BoNT dans une attaque bioterroriste reste imminente et les centres pour le contrôle et la prévention des maladies (CDC) classe désormais cet agent sous la forme “ catégorie A &#x0201d ;, en le plaçant parmi les six agents les plus prioritaires. Une étude de cas récente a prédit que la libération malveillante de botulinum dans l’approvisionnement alimentaire du public dans une attaque de bioterrorisme pourrait causer des pertes massives si un traitement efficace n’est pas facilement disponible.5 Les TBT sont synthétisés sous la forme de ∼ protoxines de chaîne qui sont activées par traduction par clivage protéolytique pour former des protéines de dichaine matures constituées d’une chaîne lourde de 100 kDa (HC) et d’une chaîne légère de 50 kDa (LC) reliées par une liaison disulfure.6 Le HC est responsable de la liaison neurospécifique , l’absorption et la translocation de la LC dans le cytosol des cellules neuronales. La LC est une métalloprotéase dépendante de Zn2 + qui clive l’une des trois protéines intracellulaires solubles dans le récepteur de la protéine d’attachement du facteur sensible N-éthylmaléimide (SNARE): syntaxine, protéine membranaire associée aux vésicules (VAMP) / synaptobrévine ou protéine synaptosomale de 25 kDa (SNAP-25) en fonction du sérotype. En conséquence du clivage des protéines, la libération d’acétylcholine à la jonction neuromusculaire est inhibée, entraînant la perte de la neurotransmission. Le traitement actuel de l’empoisonnement par le botulisme repose sur l’immunisation passive associée à des soins de soutien. Les antitoxines équines trivalentes ou les immunoglobulines d’origine humaine (BIG-IV) peuvent être administrées en prophylaxie post-exposition.2,7 Cependant, si la thérapie par anticorps peut être largement efficace, les réserves sont limitées et l’utilisation d’anticorps équins peut provoquer des effets secondaires négatifs8. De manière importante, les anticorps sont seulement capables de séquestrer les BoNT circulants libres et, par conséquent, deviennent inefficaces une fois que la toxine a commencé à pénétrer dans la cellule. Par conséquent, le diagnostic et le traitement doivent débuter rapidement après l’exposition aux toxines, soit environ 24 heures ou moins. Les clivages LC des protéines SNARE intracellulaires inhibent la fusion des vésicules synaptiques, empêchant ainsi l’exocytose de l’acétylcholine conduisant à une intoxication cellulaire. Les inhibiteurs de petites molécules de LC peuvent fournir une opportunité pour le développement de produits thérapeutiques pré- et post-exposition. Ces dernières années, le LC du sérotype A (LC / A) a été le foyer principal, principalement en raison de sa puissance et de sa longue durée de paralysie.9 Un certain nombre d’inhibiteurs compétitifs de LC / A ont été rapportés, dont les plus puissants Des valeurs de Ki de 0,16 − 12,3 μ M, 10 − 31 dont plusieurs coordonnent le cation de zinc du site actif requis pour la catalyse.13 − 31 Plus récemment, l’acide d-chicorique a été découvert dans notre laboratoire qui se lie à une région exositique en dehors du site actif LC / A, présentant une inhibition partielle non compétitive.17 Une inhibition non exclusive a été observée avec l’acide d-chicorique en combinaison avec un inhibiteur actif compétitif actif connu et démontré plus qu’additif ( synergique), l’inhibition des enzymes, 17 validant qu’un cocktail d’inhibiteurs ayant différents mécanismes d’inhibition peut s’avérer être un traitement très efficace contre le botulisme. Bien que l’on ait réussi à trouver des inhibiteurs LC / A, d’énormes ghs doivent encore être réalisés. Les découvertes facilitantes d’inhibiteurs tels que ceux cités ci-dessus reflètent la pensée contemporaine, cependant, l’émergence de plus de molécules analogues à la drogue est nécessaire. En tant que nouvelle avenue, la bibliothèque de composés cliniques de Johns Hopkins (JHCCL) composée de la FDA américaine et de médicaments approuvés étrangers a été analysée par LC / A à la recherche de nouveaux inhibiteurs.18 La bibliothèque a été criblée en utilisant un dosage FRET à haut débit dans un format de 96 puits.19 Initialement, les composés ont été évalués à une concentration unique de 50 μ M, suivie d’une confirmation par inhibition dose-dépendante.Après l’analyse de la structure chimique, 4 inhibiteurs potentiels ont été avancés. Le test basé sur FRET sert de système à haut débit, permettant un criblage rapide et efficace de milliers de composés. Cependant, le SNAPtide du substrat FRET (13 acides aminés) est une version tronquée très courte du substrat physiologique SNAP-25 de LC / A & spplus (206 acides aminés). SNAP-25 entoure la majeure partie de la circonférence de la protéase en formant un vaste réseau d’interactions protéiques et protéiques importantes pour la spécificité du substrat et l’efficacité catalytique20. L’efficacité catalytique maximale de LC / A nécessite une portion optimale de SNAP-25. composé de 57 acides aminés (146 Ê 202) .21 Par conséquent, la validation des inhibiteurs LC / A et l’élucidation de leurs mécanismes cinétiques détaillées nécessitent souvent un dosage plus fiable et plus précis. Par conséquent, les quatre candidats présentant une inhibition LC / A dans le test basé sur FRET ont été étudiés plus en utilisant un test LC MS avec un substrat 66-mer optimisé (141   206) englobant les éléments de reconnaissance clés de SNAP-25.14. Jusqu’à l’étude d’une seule lomofungine composée (Figure 1) 1) a montré une inhibition significative.Figure 1La structure chimique de la lomofungine.Lomofungine, un métabolite secondaire, a été d’abord isolé de la bactérie gram-positive Streptomyces lomodensis du sol dans le Lomofungin possède une large gamme d’activités biologiques, y compris les propriétés antibactériennes et antifongiques. Ce produit naturel s’est avéré efficace contre les levures, les champignons et les bactéries Gram-positives et Gram-négatives.22 La lomofungine ou la 1-carbométhoxy-5-formyl-4,6,8-trihydroxyphénazine fait partie de la classe des produits naturels et contient cinq substituants ajoutés sur un noyau de phénazine à trois anneaux (figure 11) .23 Pour élucider le mécanisme cinétique de l’inhibition LC / A par la lomofongine, des études d’inhibition ont été menées à diverses concentrations du substrat 66-mer et la lomofungine dans notre test LC MS.14 Un Ki de 6.7 ± 0.7 μ M a été obtenu pour la lomofungine, et l’inhibition classique non compétitive était la plus cohérente avec les résultats.Mécanisme, la lomofungine diminue la vitesse maximale (Vmax) de la réaction enzymatique n’affecte pas le Km.24 L’inhibition non compétitive prédit que la lomofungine et le substrat se lient indépendamment et de façon similaire à des sites distincts de LC / A. Ainsi, la lomofungine se lie avec une égale avidité à l’enzyme libre (E) ainsi qu’à le complexe de substrat enzymatique (ES); et le substrat se lie avec une avidité égale à E ainsi que le complexe inhibiteur d’enzyme (EI). Cela dit, le complexe ESI est inerte sur le plan catalytique24. Le comportement non compétitif de la lomofungine était inattendu puisque nous avions anticipé la liaison au sein du site actif. En tant que tel, des propriétés supplémentaires de la liaison de l’inhibiteur ont été révélées par des études d’association d’inhibiteurs. En bref, des études d’association d’inhibiteurs construites de manière appropriée révéleront si deux inhibiteurs peuvent se lier à l’enzyme simultanément. Deux inhibiteurs de site actif peuvent ne pas se lier simultanément puisqu’ils occupent tous les deux le même espace sur l’enzyme. L’interaction de deux de ces inhibiteurs est appelée liaison mutuellement exclusive et produira un effet additif sur l’inhibition de l’enzyme lorsqu’elle est utilisée en combinaison. D’autre part, si chaque inhibiteur se lie à des positions distinctes sur la surface de l’enzyme de telle sorte que chaque inhibiteur puisse se lier simultanément, l’interaction est appelée liaison non mutuellement exclusive et l’impact sur l’inhibition de l’enzyme sera synergique lorsqu’il est utilisé en combinaison. Des tracés de 1 / vitesse par rapport aux concentrations d’inhibiteur à des concentrations fixes du second inhibiteur sont diagnostiques. Si les inhibiteurs sont mutuellement exclusifs, une famille de lignes parallèles est observée. D’un autre côté, si les inhibiteurs ne sont pas mutuellement exclusifs, on observe un schéma de lignes entrecroisées. Nous avons déjà signalé l’inhibition distincte du LC / A par l’acide d-chicorique17. Similaire à la lomofungine, l’acide d-chicorique présentait une inhibition non compétitive. L’acide d-chicorique ne parvient pas à inhiber complètement l’enzyme, même à des concentrations saturantes. Nous avons démontré que la liaison à l’acide d-chicorique est non exclusive sur le site actif de l’inhibiteur compétitif 2,4-dichlorocinnamique hydroxamate.17 Etant donné que la lomofungine inhibe également de façon non compétitive, nous avons évalué l’inhibition LC / A lorsque la lomofungine était utilisée en combinaison avec d- l’acide chicorique et lorsqu’il est utilisé en association avec l’hydroxamate de 2,4-dichlorocinnamique. Les résultats de ces études de combinaison sont présentés dans la figure ​ Dans le panneau A, une liaison non mutuellement exclusive est observée entre la lomofungine et l’acide d-chicorique. La légère courbure des données et les meilleures lignes résultent de l’inhibition partielle affichée par l’acide d-chicorique (Information complémentaire).Plus clairement, les lignes d’intersection présentées dans le panneau B par la combinaison de lomofunginine et d’hydroxamate de 2,4-dichlorocinnamique indiquent une interaction de liaison non-exclusive.Figure 2 (A) Lomofungine en combinaison avec l’acide d-chicorique présentant une inhibition non-exclusive associée à une inhibition partielle . (B) Lomofungin en combinaison avec l’hydroxamate 2,4-dichlorocinnamique montrant l’inhibition non mutuellement exclusive.Nous offrons l’interprétation mécaniste suivante de ces résultats: l’inhibition, et par la déduction inférence, de la lomofongine est distincte de l’inhibiteur ciblé site actif, soit 2,4 -dichlorocinnamique hydroxamate.13 Nous utiliserons le terme exosite pour distinguer une position sur l’enzyme qui ne se chevauche pas avec la machinerie catalytique du site actif et le volume / aire contenant la région de liaison de P1 &#x02032 ;. Dans la littérature botulinique, deux exosites distinctes ont été identifiées pour LC / A.20 L’une est appelée l’exosite α ainsi nommée parce que les éléments de reconnaissance de celle-ci lient les 167   25 qui sont dans une conformation hélicoïdale alpha. Le α -exosite est éloigné du site actif, essentiellement sur la face opposée de LC / A. Le second exosite (β -exosite) se produit juste au-delà de la liaison scissile et lie les résidus SNAP-25 201 &#204 ;, 204 qui forment un β -strand. De nos études mécanistes, nous sommes incapables d’assigner sans ambiguïté un endroit spécifique sur la surface de l’enzyme où la liaison de l’inhibiteur se produit et avertir le lecteur que les exosites dans cette discussion ne sont pas nécessairement identifiés comme les α – et β -exosites déjà appelé. Cela dit, les résultats des études de combinaison de lomofungine avec l’acide d-chicorique sont plus compatibles avec des sites de liaison uniques pour chaque composé, bien que l’inhibition partielle observée avec l’acide d-chicorique rend cette conclusion plus ténue. Deux classes mécanistes d’inhibiteurs LC / A sont maintenant connu. Les propriétés distinctives sont une cinétique compétitive ou non compétitive par rapport à un grand substrat capable de mettre en prise les exosites α – et β et si elles sont capables de se lier de façon non exclusive à un inhibiteur de site actif connu. Nos données cinétiques identifient la lomofungine en tant qu’inhibiteur à base de site non actif et probablement sans chevauchement avec l’acide d-chicorique. A l’appui des emplacements de liaison distincts pour l’acide d-chicorique et la lomofungine sont les interactions observées lorsque le substrat SNAPtide plus petit est utilisé. La lomofungine, comme les inhibiteurs à base de site actif, est inhibitrice, mais l’acide d-chicorique n’inhibe pas l’hydrolyse de SNAPtide. A partir de ces observations, il est tentant de spéculer que l’acide d-chicorique peut se fixer dans une région éloignée du site actif, si loin qu’il ne chevauche pas le substrat SNAPtide, mais il interfère encore avec des substrats plus grands tels comme le 66-mer. D’autre part, la lomofungine est inhibitrice contre les substrats peptidiques grands et petits, par défaut, elle devrait se lier considérablement au site actif et chevaucher SNAPtide.Analyse de la structure chimique révèle que la lomofongine contient deux motifs 8-hydroxyquinoline connus pour chélater bivalent les métaux. LC / A nécessite Zn2 + pour la catalyse, et les composés capables de chélater le site actif étroitement lié Zn2 + se sont avérés être des inhibiteurs puissants.13 Un certain nombre de dérivés du quinolinol ont été identifiés comme inhibiteurs LC / A et leur mécanisme d’inhibition a été proposé. Une étude a estimé que les composés contenant ce motif n’étaient pas appropriés pour un développement ultérieur en tant qu’inhibiteurs LC / A en raison de la chélation de l’ion zinc du site actif.25 Cependant, une étude plus récente a montré un inhibiteur efficace du quinolinol LC / A , et il a été déterminé que l’inhibition de la protéase n’était pas due à la chélation ou séquestration de Zn2 + de LC / A.26Pour définir plus en détail le mécanisme d’inhibition de la lomofungine, nous avons étudié la métallospécificité de ce composé. Le composé simple 8-hydroxyquinoline n’a montré aucune inhibition significative de LC / A même à la concentration la plus élevée testée (500 μ M). Afin de valider davantage que la 8-hydroxyquinoline et la lomofungine ne séquestraient pas simplement le Zn2 + du site actif, les deux composés ont été évalués avec BoNT LC / B en utilisant un test basé sur FRET développé dans notre laboratoire.28 8-Hydroxyquinoline n’a montré aucune inhibition significative de le LC / B et la lomofungine présentaient une faible inhibition avec un IC50 ≥ 50 μ M. L’absence d’inhibition par la 8-hydroxyquinoline n’est pas totalement inattendue; la constante de formation (log Kav) de la 8-hydroxyquinoline pour Zn2 + est approximativement de 9,4,29, significativement plus faible que l’EDTA, un chélateur de métaux de haute affinité connu pour inhiber les métalloprotéases par séquestration de Zn2 + du site actif.30 D’après la compilation des études sur la lomogungine, la 8-hydroxyquinoline et la combinaison d’inhibition, l’inhibition de la LC / A par la lomofungine ne se fait pas par chélation directe et / ou séquestration du site actif Zn2 + et la lomofungine est un inhibiteur exclusif de la lomofungine. Sérotype LC / A. Une variété d’inhibiteurs LC / A ont été identifiés par des expériences in vitro sans cellules utilisant des formes recombinantes de l’enzyme et de l’holotoxine activée. Cependant, l’intoxication cellulaire est le résultat du clivage cytosolique de SNAP-25 par LC / A qui a été transloqué dans la cellule neuronale. Par conséquent, le potentiel thérapeutique des inhibiteurs LC / A peut être mieux évalué avec des dosages cellulaires qui surveillent le clivage intracellulaire de SNAP-25. L’efficacité cellulaire de la lomofungine a été étudiée en utilisant des neurones cérébelleux de rat primaires. La lomofungine a été ajoutée aux cellules à des concentrations variables (30 μ M à 240 μ M), suivie de l’addition de l’holotoxine BoNT / A (0,2 nM) sans prééquilibrage du composé et de la toxine27. BoNT / A, en corrélation avec la quantité de protection cellulaire par la lomofungine, est représentée sur la figure ​ À 90 μ M lomofungin fourni seulement une protection modeste (∼ 10%); cependant, une protection supérieure à 70% a été observée à la concentration la plus élevée de 150 ° M (Figure 3) .3). La CE50 calculée pour la lomofungine dans ce test cellulaire est de 131 ± 16 μ M. Cette valeur est environ 20 fois supérieure à la constante d’inhibition déterminée par rapport à la LC / A recombinante; Cependant, il est important de noter que la lomofungine a été administrée en une seule dose pour un test cellulaire de 4 h. En outre, les cellules sont des systèmes biologiques complexes et, par conséquent, d’autres facteurs tels que la perméabilité cellulaire influent sur l’efficacité des médicaments dans les modèles cellulaires.Figure 3Lomofungin inhibition du clivage SNAP-25 dans les neurones cérébelleux primaires du rat affiché comme activité relative BoNT / A, en corrélation avec En résumé, une approche de recherche intégrant le criblage à haut débit, la validation des composés, la caractérisation cinétique et le test cellulaire in vitro a été utilisée pour identifier avec succès un pharmacophore précédemment non divulgué pour l’inhibition de l’intoxication par BoNT. La lomofungine inhibe efficacement l’activité de la protéase LC / A et offre une certaine protection des neurones cérébelleux du rat contre l’intoxication BoNT / A. Nous considérons la lomofungine comme une piste intéressante avec un cadre chimique riche qui servira de précurseur pour le développement d’analogues plus puissants. Enfin, nous soulignons la liaison distincte de la lomofungine à LC / A. Il est tentant de spéculer sur la base de nos données cinétiques que la lomofungine se rapprocherait de l’exosite de la protéase tandis que l’acide d-chicorique se rapprocherait de l’exosite. Cependant, il est également possible que ces molécules se lient à des emplacements encore à définir sur l’enzyme. Les études cristallographiques sont en cours et devraient fournir des informations de liaison plus détaillées pour ces deux inhibiteurs LC / A inhabituels.