Le gène de la résistance de l’hôte Bcg

Chez la souris, la résistance et la susceptibilité à la croissance intracellulaire des mycobactéries dans les macrophages sont contrôlées par le gène Bcg Nramp, qui a été cloné et montré pour coder une protéine membranaire phagosomale macrophage avec une fonction de transporteur putative dans le gène NRAMP humain homologue, un total de des polymorphismes ont été identifiés, qui sont utilisés pour tester le lien entre les allèles NRAMP et les réponses humaines aux mycobactéries, y compris la sensibilité à la tuberculose et à la lèpre, ainsi que l’immunothérapie par le BCG dans le cancer de la vessie.

Ces dernières années, d’énormes progrès ont été réalisés dans l’identification moléculaire du gène Bcg / Ity / Lsh, le gène qui contrôle la résistance naturelle aux infections mycobactériennes, Leishmania donovani et Salmonella typhimurium chez la souris. Un gène candidat pour Bcg, Nramp pour La protéine macrophage associée à la résistance naturelle a été isolée par clonage positionnel et son homologue humain, NRAMP, a également été cloné et caractérisé. La disponibilité de sondes polymorphes pour le NRAMP humain nous permet maintenant de tester directement notre hypothèse originale, proposée il y a plusieurs années, qu’un homologue humain du gène Bcg de la souris est lié à la susceptibilité à la tuberculose et à la lèpre chez l’humain De plus, nous avons spéculé que le gène Bcg pourrait être un modulateur important de la réponse au BCG et à l’immunothérapie. et décrivez nos stratégies pour tester nos hypothèses

Caractérisation phénotypique du gène Bcg / Lsh / Ity

Le gène Bcg a été identifié par analyse d’un modèle murin d’infection mycobactérienne avec des paramètres strictement définis condition. La résistance ou la susceptibilité à l’infection a été dosée après injection intraveineuse de faibles doses × à × cfu de la souche atténuée de Mycobacterium bovis BCG de Montréal. Quelques semaines plus tard, les souris CFU ont montré une charge de BCG supérieure à celle des souris résistantes. L’analyse de ségrégation mendélienne a montré que ce trait était contrôlé par un allèle de résistance dominant Bcgr et un allèle de susceptibilité récessive Bcgs Cartographie chromosomique dans des lignées recombinantes consanguines confirmé que le locus Bcg était situé sur la partie proximale du chromosome murin D’autres expériences in vivo et in vitro ont établi que le gène Bcg est exprimé par des macrophages tissulaires matures durant la phase innée de l’infection , par contrôle de la croissance du BCG , Mycobacterium lepraemurium , complexe de Mycobacterium avium , et Mycobacterium smegmatis Moreov La distribution de la souche des allèles Bcg correspondait exactement à celle de la résistance / susceptibilité à S typhimurium Ity et L donovani Lsh Avant de cloner le gène Bcg candidat Nramp discuté ci-dessous, le travail de plusieurs laboratoires avait caractérisé le Bcg / Ity / Lsh par son expression fonctionnelle dans les macrophages Ces effets pléiotropiques du gène Bcg sont des paramètres de l’activation des macrophages qui sont régulés à la hausse dans les macrophages à partir de souches de souris congéniques Bcgr ou dans les lignées cellulaires de macrophages clonés dérivés de lignées congéniques Bcgr de souris Cependant, un produit spécifique lié à l’activité bactéricide contrôlée par le gène Bcg n’a jamais été identifié. L’intérêt récent a porté sur le rôle possible du gène Bcg dans l’acide nitrique. NO oxyde métabolisme NO et NO intermédiaires connexes ont été corrélés avec la destruction des mycobactéries et l eishmania par les macrophages Le gène Lsh a été trouvé pour réguler la production de NO dépendante du TNF ; Cependant, des résultats contradictoires ont été obtenus pour les niveaux de NO dans les macrophages de souris Bcgr et Bcgs

Le gène candidat Bcg Nramp

L’identification d’un gène candidat pour Bcg était l’aboutissement de plusieurs années de travail, qui a commencé avec la construction d’une carte de liaison génétique à haute résolution de la région Bcg sur le chromosome Le résultat de cet effort était de réduire la intervalle de cM chevauchant Bcg à un intervalle plus « clonable » de cM Une carte physique de cet intervalle a ensuite été construite et établie l’intervalle physique Bcg de Mb Les marqueurs les plus fortement liés à Bcg dans cet intervalle ont été utilisés pour assembler un contig de clones de chromosomes artificiels de cosmides et de levures de la région Bcg Le criblage du contig cosmidique par « exon piégeage » a conduit à l’identification de plusieurs unités de transcription candidates L’analyse de transfert de clones de clones d’ADNc correspondant à des gènes candidats a déterminé que l’expression de comme Bcg, restreint aux macrophages spléniques; Ce gène a été désigné Nramp L’analyse de séquence indique que Nramp murin code une protéine d’acide aminé avec des domaines transmembranaires transmembranaires TM, des sites potentiels de glycosylation N-liés et des sites de phosphorylation de protéine kinase C Ces caractéristiques structurelles Nramp est un transporteur membranaire dépourvu de sites de liaison adénosine triphosphate Deux motifs conservés clés dans la séquence prédite Nramp sont des indices de la fonction Nramp Premièrement, la présence d’une «signature de composant membrane interne du système de transport dépendant des protéines» située entre prédite TM et TM, un motif également trouvé dans le gène CrnA d’Aspergillus qui fonctionne comme une perméase pour l’absorption de nitrate, a conduit à l’hypothèse que Nramp peut fonctionner comme un transporteur de nitrates Deuxièmement, la présence d’une région amino-terminale avec l’identité à des domaines SH d’homologie Src, censés induire des associations protéine-protéine nécessaires à la transduction du signal, suggère rôle de Nramp dans la transduction du signal On a postulé que la protéine Nramp pourrait fonctionner à la fois dans le transport des nitrates et dans l’activation des macrophages, puisque NO est elle-même une molécule bifonctionnelle impliquée à la fois dans la transduction du signal. L’ADNc des souches Bcgr et Bcgs a révélé que la susceptibilité à l’infection est associée à une substitution glycosine-acide aspartique non conservatrice dans la MT prédite L’association exclusive de l’acide aspartique avec le phénotype Bcgs suggère fortement que cette mutation cause la susceptibilité. a été confirmée par des résultats d’expériences récentes de knockout de gènes qui sont en accord avec l’hypothèse que NrampAsp est une mutation nulle De plus, la recombinaison homologue confirmera si l’allèle Nramp résistant peut corriger le phénotype Bcgs Last, analyse des cellules transfectées avec ADNc Nramp va localiser le compartiment de la membrane à laquelle Nramp est ciblé d et pourrait aider à élucider la fonction et le substrat transportés par Nramp, ainsi que de déterminer si la mutation de l’acide aspartique dans TM est la mutation causant la maladie

NRAMP humain

Le gène NRAMP humain, situé sur le chromosome q, a une longueur d’ADNc de ~ kb et une longueur génomique de kb, contenant des exons NRAMP peut coder un -kDa, protéine membranaire polytopique avec – TM domaines L’identité globale avec la souris Nramp est% La NRAMP humaine possède le motif de transport structurel, un domaine SH caractéristique des protéines de signalisation, et un total de sites pour la protéine kinase C De plus, l’analyse de la région promotrice de NRAMP a identifié des éléments de région promotrice inductible pour IFN-γ, indiquant que l’expression de Nramp peut être régulée différemment Le haut degré de conservation des séquences nucléotidiques et les motifs structuraux entre Nramp humain et souris suggère fortement que les protéines ont des fonctions similaires. différences existent Tout d’abord, tous les gènes humains NRAMP séquencés jusqu’à présent ont une glycine à la position dans TM Cela suggère que les substitutions de la glycine dans TM ar e non toléré chez les humains NRAMP et aussi que la mutation causant la susceptibilité sont différentes chez la souris versus NRAMP humaine. Deuxièmement, bien que Nramp humaine et souris sont exprimés dans les macrophages , il y a divergence dans le site tissulaire entre les espèces. de NRAMP humain a été trouvé dans les lymphocytes du sang périphérique et dans les poumons Cette dernière observation est très pertinente pour la tuberculose, car la cellule hôte de Mycobacterium tuberculosis est le macrophage alvéolaire . Cependant, les macrophages humains n’utilisent pas la NO synthase pour générer du NO pour la destruction microbienne suggère que si NRAMP humain est impliqué dans la susceptibilité à la tuberculose, il peut être par l’altération de l’activation des macrophages plutôt que par l’inhibition directe de la destruction microbienne

Tester notre hypothèse génétique

Des preuves suggestives de la susceptibilité génétique à la lèpre et à la tuberculose chez l’homme sont connues depuis des décennies et incluent le regroupement de la maladie dans certains groupes ethniques, familles et populations indigènes non encore exposées De plus, deux études ont montré la concordance de la tuberculose. Plus récemment, une analyse de ségrégation de la lèpre a révélé que l’hérédité de la susceptibilité à la lèpre en soi, signifiant une maladie cliniquement évidente, était compatible avec un seul gène codominant ou récessif qui ne l’était pas. Cependant, d’autres analyses ont suggéré que l’expression de la maladie mycobactérienne humaine est multifactorielle et génétiquement hétérogène Par conséquent, bien que l’on puisse raisonnablement attendre le NRAMP humain gène pour contribuer à la susceptibilité aux maladies, on ne devrait pas Notre précédente stratégie a consisté à effectuer une analyse de liaison de polymorphismes spécifiques de l’ADN chromosomique avec le caractère de résistance / susceptibilité à la tuberculose et à la lèpre dans des familles multiplex à partir de zones de endémicité dans le monde La ségrégation des allèles parentaux informatifs entre frères et sœurs affectés et non affectés est évaluée par le logarithme de l’analyse des cotes de chance Nous avons modifié la stratégie pour tester si le gène de susceptibilité mycobactérienne humaine est NRAMP; nous discutons de cette approche ci-dessous

Marqueurs de gènes

Avant toute analyse du rôle de NRAMP dans la susceptibilité aux maladies infectieuses, les allèles NRAMP devaient être identifiés. Dans un premier temps, pour dériver les marqueurs polymorphiques NRAMP utiles aux études génétiques, nous avons établi l’organisation exon-intron du gène De cette façon, il était possible de dériver des amorces spécifiques à l’exon qui permettaient l’amplification enzymatique de chaque exon individuel, qui pouvaient ensuite être analysées pour la présence de variants de séquence spécifiques. et les variantes de séquence figurent dans ou dans les régions non traduites UTR de NRAMP

Figure Vue largeDownload slideLocalisation des polymorphismes et des variants de séquence dans le gène NRAMP humain Les exons sont indiqués par les barres verticales noires, numérotées -, et l’échelle correspondante pour le gène est indiquée en kb ligne horizontale supérieure La barre verticale blanche est un exon épissé alternativement ] Figure Vue largeDownload slideLocalisation des polymorphismes et des variants de séquence dans le gène NRAMP humain Les exons sont indiqués par les barres verticales noires, numérotées -, et l’échelle correspondante pour le gène est indiquée en kb ligne horizontale supérieure La barre verticale blanche est un exon épissé alternativement Huit des variants de séquence ont pu être identifiés par la présence ou l’absence d’un site d’enzyme de restriction spécifique, ce qui a permis le développement de polymorphismes de longueur de fragments de restriction RFLP-PCR pour ces marqueurs . dans un changement d’acide aminé: une substitution alanine-valine située entre le cinquième et le sixième domaine TM Dans une autre expérience, nous avons cloné un fragment d’ADN -bp à partir de l’UTR de NRAMP et identifié un membre de la famille Alu J qui est intégré dans cette dernière. Segment d’ADN dans une orientation opposée à la direction de la transcription NRAMP Une insertion / délétion polymorphique-bp a été détectée à l’extrémité ‘-end de l’élément Alu De même, un polymorphisme de longueur répétée a été détecté dans l’UTR du gène NRAMP [ Les variations polymorphiques au sein des UTR peuvent être significatives pour l’association avec la maladie Par exemple, dans le cas de la dystrophie myotonique, les mutations au sein de l’UTR du gène de la myotonine kinase sont causalement liées à la maladie Nos efforts actuels se concentrent sur l’informativité de tous Marqueurs polymorphiques NRAMP dans différentes populations ethniques Il est bien connu que la fréquence des allèles pour de nombreux gènes, tels que HLA, dépend de l’origine ethnique, et les marqueurs NRAMP ne sont pas e xception Par conséquent, pour définir les sondes NRAMP avec un degré élevé d’hétérozygotie, les fréquences alléliques doivent être déterminées pour chaque sonde dans des populations témoins appariées.

Analyse génétique moléculaire de la réponse au traitement BCG pour les tumeurs de la vessie chez les humains

Comment le gène Bcg pourrait affecter les réponses à l’immunothérapie par le BCG et la vaccination par le BCG chez les humains est une question qui nous intéresse depuis longtemps La vaccination contre la tuberculose avec BCG atténué est en vigueur depuis, et il a été estimé que & gt; Cependant, l’efficacité protectrice du BCG a varié considérablement, de% à%, dans plusieurs des principaux essais de vaccination, ce dernier chiffre reflétant une susceptibilité accrue à la tuberculose après la vaccination [,,] Les raisons de la variation On ne sait toujours pas, mais une explication possible est que les gènes de l’hôte pourraient avoir influencé la protection de la vaccination par le BCG. Une des façons dont nous abordons cette question est d’analyser génétiquement la réponse au BCG pour le cancer de la vessie. Le traitement par le BCG réduit le nombre et la fréquence des récidives tumorales vésicales et peut également être efficace dans le traitement des lésions néoplasiques résiduelles Bien que les avantages cliniques du BCG soient évidents chez une proportion significative de patients, les tumeurs réapparaissent chez moins de% des personnes traitées Si le mécanisme exact de l’effet du BCG sur les tumeurs de la vessie est encore inconnu, le degré d’immunité à médiation cellulaire semble être important pour la réponse antitumorale dans la vessie. , une réponse granulomateuse et un infiltrat de cellules mononucléaires sont provoqués par la croissance locale de BCG après instillation de BCG examinée ailleurs dans ce symposium Comme la croissance du BCG dans les macrophages et l’activation des macrophages est connue pour être régulée par l’expression du gène Bcg dans le système murin [ ], nous proposons qu’un homologue humain du gène Bcg de la souris, NRAMP, contrôle la réponse des patients atteints de tumeurs de la vessie au BCG. Nous étudions cette hypothèse en recherchant un déséquilibre de liaison entre des marqueurs génétiques étroitement liés ou situés dans le gène NRAMP humain. réponse phénotypiquement définie à la thérapie BCG chez les patients atteints de tumeurs de la vessie La génération de marqueurs hautement polymorphes Le phénotype de la réponse de susceptibilité à la thérapie chez ces patients est le suivant: le NRAMP a permis d’établir des haplotypes d’allèles NRAMP susceptibles d’être associés à la réponse à l’immunothérapie par le BCG dans une cohorte de patients répondeurs et non répondeurs atteints de tumeurs de la vessie et de sujets témoins sains appariés. défini comme la disparition complète de la maladie, documenté par des résultats cystoscopiques normaux, des résultats négatifs de biopsie aléatoire, et des résultats normaux d’analyse cytologique d’urine Le phénotype de résistance à l’échec thérapeutique de traitement est défini comme la cessation de traitement due à la persistance, la récurrence ou la progression Une association significative des haplotypes NRAMP avec l’un de ces phénotypes cliniquement définis apportera une preuve directe du rôle du gène NRAMP dans le contrôle de la réponse à l’immunothérapie par le BCG et suggérera l’utilisation des variants NRAMP comme marqueurs prédictifs du succès de l’instillation du BCG dans la vessie. thérapie contre le cancer

Conclusion

Les résultats de notre analyse génétique des polymorphismes NRAMP avec susceptibilité aux maladies mycobactériennes humaines et la réactivité au BCG peuvent être appliqués aux conceptions thérapeutiques. Premièrement, si NRAMP s’avérait contribuer aux réponses de l’hôte aux mycobactéries, la protéine NRAMP représenterait alors une cible pour l’intervention pharmacologique. renforcer les défenses de l’hôte contre les mycobactéries Deuxièmement, étant donné que les vaccins recombinants utilisant le BCG en tant que vecteur sont actuellement proposés, l’information sur la susceptibilité génétique dans les populations sera utile pour planifier l’application de ces vaccins