PAR2 Modulateurs dérivés de GB88

PAR2 Modulateurs dérivés de GB88

Récepteur activé par la protéase

2 (PAR2) est un récepteur couplé aux protéines G activé par les protéases endogènes.1,2 PAR2 est activé dans divers types inflammatoires, respiratoires, gastro-intestinaux,

maladies cardiovasculaires, neurologiques et métaboliques, ainsi que la peau

conditions et douleur.1,3 − 10 L’inhibition des fonctions de PAR2 pourrait avoir un potentiel thérapeutique

applications dans le traitement de ces maladies. Des quelques antagonistes de PAR2

connu, ENMD1068 (1) est un antagoniste faible au millimolaire

concentrations.11 K-14585 (2) est un antagoniste faible à de faibles concentrations micromolaires de peptide

agonistes selon un test de gène rapporteur de la B-luciférase, 12 mais pas de protéases endogènes comme la trypsine.13 C391 (5, Figure &#11) a inhibé les voies de signalisation Ca2 + et MAPK médiées par PAR2 à des concentrations micromolaires. 14 Il y a quelques autres antagonistes de petites molécules

rapporté dans les brevets (non illustré) .15 Notre

groupe précédemment identifié le premier micromolaire – nanomolaire

antagonistes GB88 (3) et GB83 (4) 16,17 qui inhibaient l’activation PAR2 de la libération de calcium intracellulaire (iCa2 +) induite par tous les agonistes connus de PAR2, y compris les protéases

(par exemple, la trypsine) ou des agonistes peptidiques synthétiques (par exemple, SLIGRL-NH2, 2fLIGRLO-NH2) ou des agonistes non peptidiques (par exemple GB110).

dans plusieurs lignées cellulaires humaines.17 Leur potentiel

applications thérapeutiques ont été démontrées pour 3in vivo dans les modèles de rats inflammatoires à la fois aiguë et chronique.17 − 20Figure 1Chemical

structures d’antagonistes de PAR2 (1 – 5) et d’optimisation modulaire (encadré) dans cette étude. Cette étude rapporte les relations d’activité de structure et # x02013;

(SARs)

dans laquelle chaque composant (isoxazole, cyclohexylalanine, isoleucine,

spiro [indène-1,4 ′ -piperidine]) de 3 (Figure ​ Figure 11) est modifié pour gagner

plus de compréhension de leurs contributions à la modulation PAR2 (Figure ​ Figure 22). Nous proposons que

chaque motif (isoxazole, Cha, Ile, C-terminal) se lie à différentes régions

de PAR2 pour moduler les voies de signalisation en aval, menant à la découverte

de ligands polarisés contrôlés par voie sélective.Figure 2 Modifications modulaires à chaque

composant de 3.Chaque motif a été remplacé par différentes moitiés, et le

Antagoniste de PAR2 / agoniste

les activités ont été évaluées initialement par la libération de calcium intracellulaire (iCa2 +) dans des cellules de carcinome colorectal humain (HT29). Tout

ligands ont d’abord été criblés pour l’activité antagoniste à deux concentrations

(10 et 100 μ M, Figure ​ Figure 33), et ceux montrant une inhibition significative (> 30% à 10

μ M)

ont été criblés pour l’activité agoniste (à 10 μ M) pour établir

que l’inhibition observée n’a pas été causée par un récepteur induit par un agoniste

désensibilisation.16 Antagonistes prometteurs

ont été évalués plus loin sur des plages de pleine concentration pour déterminer

Inhibition demi-maximale (IC50) de la libération d’iCa2 +

et profilé dans d’autres essais fonctionnels tels que la stimulation AMPc et

Phosphorylation ERK1 / 2. Les propriétés des antagonistes de PAR2 ont ensuite été brièvement

examiné in vitro et in vivo dans

modèles d’inflammation. Figure 3: Criblage initial de composés représentatifs

à 10 μ M (> 30%

inhibition) pour réduire l’efflux de calcium dans les cellules HT29 provoquées par

1 μ M 2-f-LIGRLO-NH2. Les données sont des moyennes ± SEM (n ≥ 2). Les composés 12, 19, 49, 50, 52 et # x02013; … Le rôle des amides épine dorsale de 3 a d’abord été étudié

grâce à la N-méthylation. Aucun des deux dérivés mono-N-méthylés de 3 n’a montré d’activité.

Ceci indique l’importance des deux amides de la colonne vertébrale, probablement due

pour maintenir une conformation trans-amide préférée

pour présenter des chaînes latérales ou pour la liaison hydrogène au récepteur.SAR autour du motif isoxazole de 3 a été étudié

en utilisant des fractions cycliques ou acycliques différant en hydrophobicité, en taille,

la saturation et la polarité (Figure ​ Figure 22). Seuls les hétérocycles aromatiques à 5 chaînons étaient généralement

toléré (14, 17 – 18 et 20 avec 53, 91, 62 et 70% d’inhibition à 10 μ M).

Autres ligands avec des groupes amine ou guanidine chargés positifs (6 – 8), urée (9), hydroxyéthyle

ou des benzylurées (10 – 11), des aromatiques volumineux

(28 – 31), groupes alkyle et aminoalkyle

(32 – 34), les imitations de sérine (35 – 38), ou les hétérocycles non aromatiques (39 – 42) étaient moins puissants (Figure ​ Figure 33). Commutation de la position relative

de l’oxygène / azote du 5-isoxazole

(3) en 3-isoxazole (12) ou 5-oxazole (15) était préjudiciable à l’activité antagoniste. L’isomère 12 a montré une faible inhibition (27%), probablement due à un faible agoniste

activité (activation à 21%, informations à l’appui, figure S1). Contrairement à l’observation chez les agonistes peptidiques,

en cas de remplacement de la sérine de SLIGRL-NH2 par le 2-furane

produit l’agoniste de PAR2 le plus actif 2f-LIGRLO-NH2,21 remplacement de 5-isoxazole dans 3 avec l’activité abolie 2-furan (13) ou serine (36). Les résultats suggèrent que 3 pourraient

partagent le même site de liaison ou se chevauchant en tant qu’agonistes peptidiques (par ex.

2f-LIGRLO-NH2) mais se lient différemment au site

le premier résidu (5-isoxazole vs 2-furane ou sérine). En particulier,

la propriété de l’accepteur de liaison H aux positions méta et / ou ortho sur le 5-isoxazole pourrait jouer un rôle dans la liaison

et fonction. Par conséquent, une série d’hétéroaromatiques avec de telles propriétés

ont été étudiés. L’imidazole (14) et le triazole (16) ont conservé une activité antagoniste avec une activité réduite (53%

et 43%, respectivement). La position 3 de l’anneau 5-isoxazole est connue

être le principal site métabolique des médicaments à base d’isoxazole22,22. L’ajout d’un groupe amino à cette position pourrait améliorer le métabolisme

stabilité et former une interaction H-liaison supplémentaire avec PAR2. cependant,

le 3-amino-5-isoxazole (17) résultant a montré

puissance antagoniste à 3 (91% et 92%, respectivement, ou

IC50 1 – 2 μ M, Tableau 1). Introduire de la flexibilité en étendant la

distance entre le groupe amino et l’isoxazole en utilisant un espaceur méthylène

(18) ont conduit à une réduction de la puissance antagoniste (62%, IC50 8,9 μ M). Remplacement de l’oxygène du cycle du 3-amino-5-isoxazole

(17) avec un donneur de liaison H (NH) a donné le 3-amino-5-pyrazole

(19), qui est passé à un agoniste faible (activation de 26%, information d’appui Figure S1). Substitution

l’isoxazole avec l’antagoniste réduit du 2-amino-4-thiazole (22)

activité (30%) mais, étonnamment, l’analogue 4-thiazole (20, 70%) a montré une certaine activité antagoniste tandis que le composé 5-thiazole

(21) était inactif à 10 μ M. L’imidazole 14, le pyrazole 19 et le triazole 16 peuvent exister sous des formes tautomères, ce qui fait que l’azote méta agit comme donneur ou accepteur de liaison H. Enlèvement de H-bond

donneur / accepteur à la position méta aboli l’activité,

démontré par les analogues du furane (13) et du thiophène (23), suggérant qu’un accepteur de liaison H à la position meta est important pour l’antagonisme et la puissance. Le pyrazole (24), contenant un accepteur de liaison H à la position méta mais pas ortho, a été réduit de 10 fois

puissance.

Remplacement des hétéroaromatiques contenant cinq à six atomes d’azote,

tout en conservant le même type de propriété d’accepteur de liaison H à la méta-position (par exemple, pyridine 25, 6-aminopyridine 26 et pyridazine 27),

puissance antagoniste. Ceci est cohérent avec l’acceptation renforcée des liaisons H

de 5 à 6 chaînons contenant de l’azote contenant des hétérocycles, 24 le premier étant plus riche en électrons. En particulier,

l’oxygène vicinal dans 5-isoxazole pourrait augmenter la puissance d’accepteur de liaison H

de l’azote méta. Contrairement à d’autres motifs de liaison,

la taille du substituant à cette position n’affecte pas directement

activité (Figure ​ Figure 44a).

Un minimum de deux hétéroatomes (azote ou oxygène, comme dans 3) agissant comme accepteurs de liaison H est requis dans les hétéroaromatiques à cinq chaînons

pour la puissance antagoniste. Les antagonistes de PAR2 ont été trouvés avec une alternative

hétéroaromatiques, tels que l’imidazole (14) ou 3-substitué

Les analogues de 5-isoxazoles (17 et 18, IC50 1 – 9 μ M, Tableau 1), qui peuvent avoir une meilleure stabilité métabolique et une meilleure solubilité,

mais la puissance devrait être obtenue par des changements ailleurs dans le

structures.Figure 4Relations entre le volume de la chaîne latérale

et% d’inhibition à 10

μ M iCa2 + induit par 2f-LIGRLO-NH2 (1 μ M).

Point solide (antagoniste 3), points ouverts (ligands de PAR2 de la figure Ý Figure 22). Tableau 1 Inhibiteurs de PAR2 représentatifs représentatifs

Effet iCa2 + dans les cellules HT29 induites par les peptides agonistes de 2f-LIGRLO-NH2 (1 μ M) aPar PAR2, il a été rapporté

cela change à

le second résidu de SLIGRL-NH2 de la leucine à la phénylalanine a entraîné une perte de sélectivité

pour PAR2 sur PAR1.25 Pour cette raison aromatique

les anneaux ont été exclus à cette position. La taille de la complémentaire

poche de liaison a été sondé en utilisant des groupes alkyle hydrophobes de légèrement

taille variable, comme la tert-butylglycine (tBuG, 43), l’homocyclohexylalanine (hCha, 45), et la morpholine (44) (figure ​ figure 22), mais aucun remplacement n’a réussi. Ensemble

avec la connaissance des agonistes peptidiques PAR2, 26 Cha était le meilleur substituant sur ce site (3, solide

point, Figure ​ Figure44b), plus

probablement en raison de l’optimisation de l’espace hydrophobe et van der Waals

interactions avec les études d’agonistes peptidiques PAR2.PAR2 rapportées

cette position 3 était intolérant

de substitution des acides aminés plus petit que Ile et plus volumineux que Cha.25 Etant donné que cette poche de liaison est relativement petite

Dans notre modèle d’homologie PAR2, 26 groupes seulement

de taille similaire à Ile et Cha ont été sélectionnés. Groupes alkyle tels que gem-diméthyl (46), t-butyle

glycine (47), et Cha (48) (Figure ​ Figure 22) ont montré une puissance réduite (10 – 16%

inhibition). Des groupes polaires sélectionnés de taille similaire à Ile ont été incorporés,

comme la thréonine (49), O-méthylée

la thréonine (50, un isomère CH2 à O d’Ile),

α, γ -diaminobutyrique (51), asparagine

(52), et l’histidine (53), pour enquêter

interactions polaires ou H-liaison avec le récepteur. Cependant, tous induits

Activation PAR2 (53 – 81%, sauf 11% pour 51, Informations de support Figure S1). Le support de données

une poche hydrophobe pour la puissance antagoniste, avec Ile (3, point solide, figure ​ Figure 44c) comme substituant optimal. Groupes polaires à cette position commutée

antagonistes aux agonistes.Il a été suggéré que PAR2 peut

avoir une poche hydrophobe

Le spiro [indène-1,4 ′ -piperidine] de 3 a été remplacé par différents groupes hydrophobes aliphatiques ou aromatiques.

Les fragments spiro ou bicycliques couramment trouvés dans les ligands GPCR étaient donc

Incorporated.28 Composés spiro avec liaison H

accepteurs (54, 56, 57) sont devenus

agonistes puissants (CE50 0,7 – 1,8 μ M ou 62 – 70%

activation, Informations de support Figure

S1). L’élimination de l’oxygène carbonyle (57 à 58) a complètement rétabli l’activité antagoniste avec une puissance similaire à 3 (inhibition de 77% ou IC50 1,9 μ M, Tableau 1). Une logique similaire

était clair pour un autre couple antagoniste / agoniste 3 et 54, alors que ce dernier contenant un époxyde vs double liaison

(en 3) à cet endroit était un agoniste (65% d’activation).

Dérivé de tétrahydroisoquinoline bicyclique 59 a montré

une réponse agoniste (65% d’activation), peut-être parce que l’un des

deux groupes méthoxy ont été présentés dans la même position déclenchant le lien H

activation du récepteur induite par l’accepteur. La bicyclette complètement saturée 60 (cis-decahydroisoquinoline) a modéré

activité antagoniste (inhibition de 38%) et élimination d’un cyclohexane

anneau (61, également avec un tert-butylamide

groupe à la position-2 de la pipéridine comme dans 60) amélioré

activité antagoniste (inhibition de 64%, IC50 8,6 μ M).

Les résultats suggèrent un espace disponible autour de la position 2 de la pipéridine

anneau de 61. Pipérazines et pipéridines substituées

sont d’autres classes de commun

fragments trouvés dans divers ligands de GPCR.28 Les pipérazines sont facilement dérivés au niveau de l’azote du cycle à la position

4. Cependant, l’azote de l’anneau supplémentaire peut changer les propriétés électroniques

et faire une interaction polaire avec le récepteur pour déclencher l’activité agoniste.

Les candidats à la pipérazine (62 – 64)

étaient en effet tous des agonistes (30 – 50% d’activation, information de support Figure S1). Par conséquent, l’attention était

concentré sur les pipéridines. Prometteur, un analogue de 3 créé en enlevant l’anneau spiro à 5 membres, 4-phénylpipéridine

(65), ont montré une activité antagoniste améliorée (93% d’inhibition

ou IC50 0.7 μ M) .Phenylpiperidine 65 a été modifié en incorporant

électrodonneur (MeO, 67 et 68) ou électro-attracteur

(chloro, 66, trifluorométhyl, 69 et 70), mais tous ont montré une activité antagoniste réduite (43 – 69%

inhibition). Présentation d’un groupe acétamido (71) commuté

le rôle d’agoniste (81% d’activation), soutenant des observations antérieures

qu’un accepteur de liaison H à cet endroit a conduit à l’activation du récepteur.

Pour sonder la taille de cette poche de liaison C-terminale, en insérant un méthylène

espaceur entre la pipéridine et le phényle (72) ou incorporant

un groupe phényle (73 – 75) ou phénoxy (76) conduit à une réduction de l’antagonisme ou de l’inactivation. Nos découvertes

indiqué que l’espace autour du cycle phényle de la phénylpipéridine est

limité et un phényle non substitué est optimal. Figure ​ Figure44d suggère que les substituants plus grands que

spiroindenepiperidine (3, point solide) n’étaient pas tolérés,

tandis que les plus petits groupes n’ont pas réduit significativement la puissance antagoniste.

Fait important, le motif C-terminal a également déterminé agoniste / antagoniste

fonction principalement par une propriété acceptant H-liaison, qui manquait

dans tous les antagonistes analogues mais présents dans les agonistes, tels que le

paires 3 vs 54 (double liaison vs époxyde), 58 vs 57 (méthylène vs céto carbonyle) et 65 vs 62/71 (CHPh vs NPh / acétamido-CPh). Les antagonistes sélectionnés identifiés dans le test iCa2 + étaient

évalué sur une plage de concentration complète pour déterminer la CI50, qui a montré une activité comparable à 3 (Tableau 1, Informations à l’appui, Figure S2). L’antagoniste le plus puissant 65 a inhibé la libération d’iCa2 + dans le carcinome colorectal humain

(HT29) induites par deux types d’agonistes de PAR2, par exemple un peptide

2f-LIGRLO-NH2 (IC50 0,7 μ M) et endogène

protéase trypsine (IC50 2,2 μ M), et était légèrement

plus puissant que 3 (CI50 1.1 et 3.6 μ M,

respectivement). En outre, 65 étaient sélectifs pour PAR2 sur

PAR1. Puisque les cellules HT29 n’expriment pas PAR1 dans nos mains (Information à l’appui Figure S3), nous avons examiné 65 pour la sélectivité PAR2 vs PAR1 dans le cancer de la prostate humain (PC3)

cellules, qui expriment à la fois PAR2 et PAR1 (Informations de support Figure S3). Le composé 65 inhibé

La libération d’iCa2 + induite dans les cellules PC3 par 2f-LIGRLO-NH2 (IC50 4,5 μ M) ou la trypsine (IC50 6,5 μ M), mais n’a eu aucun effet sur l’inhibition de la libération d’iCa2 +

stimulée par deux agonistes sélectifs de PARI, par exemple, la protease α -thrombine

et peptide TFLLR-NH2 (Figure ​ Figure 55a) .Figure 5Profiling signalisation et propriétés anti-inflammatoires

du composé 65 dans des essais fonctionnels PAR2. (a) Le composé 65 inhibe sélectivement la libération de iCa2 + induite dans

Les cellules PC3

par deux agonistes de PAR2 différents à leurs concentrations EC80:

trypsine endogène (&#x025cb ;, … Le composé 65 était un

antagoniste compétitif et surmontable

contre 2f-LIGRLO-NH2 comme déterminé par l’analyse de Schild plot

(Informations à l’appui Figure S4). Similaire

à 2f-LIGRLO-NH2, 65 était un PAR2-sélectif

agoniste dans l’activation de la phosphorylation de ERK1 / 2 (figure ​ figure 55b) et inhibition de la stimulation de l’AMPc (figure ​ figure 55c). Sélectivité PAR2

a été encore soutenu par l’activité agoniste pour 65 à la fois

dosages dans des cellules CHO transfectées par PAR2 mais non par vecteur. Plus important encore,

la concentration de 65 requise pour inhiber la mobilisation de iCa2 + induite par 2f-LIGRLO-NH2 dans les cellules HT29 était

similaire à celle nécessaire pour activer les réponses ERK1 / 2 et cAMP (0.1 – 2.2

μ M) .Trois antagonistes (3, 17, 65) ont été examinés pour la stabilité dans le plasma de rat et

homogénats de foie de rat

sur une période de 3 h (informations de support, figure S5) et comparé avec le peptide SLIGRL-NH2. Dans le plasma de rat, les antagonistes étaient stables pendant 3 h (75% intact),

tandis que l’hexapeptide SLIGRL-NH2 s’est dégradé rapidement (t1 / 2 ≈ 20 min). Dans les homogénats de foie de rat,

la demi-vie d’élimination de ces composés était inférieure à 60 min

dans l’ordre de classement 3 (t1 / 2 ≈ 60 min) > 65 (∼ 30 min) > SLIGRL-NH2 et 3-aminoisoxazole 17 (∼ 15 min). Oral

l’administration des antagonistes aux rats (10 mg / kg dans l’huile d’olive)

cet analogue 17 a donné une pharmacocinétique presque identique

profil à 3 (19) (données non montrées),

tandis que la phénylpipéridine (65) a montré une concentration plasmatique plus faible

plus de 6 h (ASC6h 1964 ng · h / mL comparé à 3420 ng · h / mL

pour 3, information de support figure S5 et tableau S1). Semblable à 3, le composé 65 a atteint la concentration plasmatique maximale 2 et 3 h après

une dose orale, avec une concentration plasmatique maximale atteignant ∼ 2

× IC50 valeur in vitro.Antagonistes 17 et 65 ont été étudiés ici

dans un modèle d’inflammation de la patte de rat aiguë établi.11,17 Administré par voie orale à raison de 10 mg / kg (dans l’huile d’olive) dans l’œdème du rat

modèle, à la fois 17 et 65 considérablement réduit

gonflement articulaire induit par l’agoniste PAR2 2f-LIGRLO-NH2 (350

μ g / patte dans 100 μ L solution saline. p < 0,05

mesures répétées ANOVA, comparaison planifiée de bonferroni), avec efficacité

comparable à 3 (Figure ​ Figure 55d). La biodisponibilité orale estimée (ASC6h) de 65 était inférieure à 3, mais une efficacité in vivo comparable étayait sa plus grande activité antagoniste PAR2.

déterminé in vitro. L’activation de PAR2 est connue

pour induire la libération de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, IL-8, TNF – α). 30 − 32 Compte tenu de la forte abondance de PAR2 dans le rein et son pro-inflammatoire

rôles, 33 nous avons étudié les agonistes PAR2

et des antagonistes dans les cellules épithéliales primaires des tubules rénaux humains (HTEC).

HTEC stimulant avec l’agoniste PAR2 (2f-LIGRLO-NH2) augmenté

TNF – α et la sécrétion d’IL-6. Prétraitement avec l’antagoniste de PAR2 65 inhibé de manière dose-dépendante stimulé par 2f-LIGRLO-NH2

la sécrétion de cytokines (Figure ​ Figure 55e, f), en corrélation bien avec l’activité anti-inflammatoire dans

En résumé, cette étude SAR (Figure ​ Figure66) autour de notre antagoniste précédent 3 (GB88)

conduit à la découverte de plusieurs antagonistes PAR2 micro-à submicromolaires faibles

dans un essai de libération d’iCa2 + (cellules HT29, PC3, CHO-PAR2).

Un interrupteur agonisme / antagonisme a été trouvé et harnaché pour antagoniste

conception. Les tailles optimales ont été identifiées pour les motifs de composants remplaçant

isoxazole, isoleucine, cyclohexylalanine et fragments C-terminaux.

Les influences de chaque composante sur l’agonisme par rapport à l’antagonisme ont été attribuées

à l’ajustement variable des poches de liaison dans les régions transmembranaires de

PAR2, qui pourrait aider les études de membrane-dépendante (éventuellement dépendante de la voie)

signalisation médiée par PAR2. Retrait d’un accepteur H-liaison à trois

les quatre motifs étaient essentiels pour maintenir l’activité antagoniste. Un représentant

antagoniste (65, désigné AY117) était légèrement mieux

que 3 en tant qu’antagoniste PAR2 dans l’inhibition de PAR2 activé

La libération d’iCa2 + induite par la trypsine native ou synthétique

agonistes peptidiques (2f-LIGRLO-NH2). Le composé 65 était un antagoniste compétitif et insurmontable de l’agoniste 2f-LIGRLO-NH2 dans la régulation de iCa2 +. Cependant, comme 2f-LIGRLO-NH2, c’est un agoniste sélectif PAR2 dans l’inhibition de la stimulation de l’AMPc

et activant la phosphorylation de ERK1 / 2 à des concentrations similaires (0,1 – 2.2

μ M). Les nouveaux ligands sont stables dans le plasma de rat, actifs par voie orale,

et montrent une activité anti-inflammatoire in vivo comparable

(3) dans un modèle d’œdème de la patte de rat, compatible avec leur capacité

pour atténuer l’effet induit par un agoniste de PAR2

cytokines pro-inflammatoires sécrétées in vitro. Celles-ci

les résultats connectent la fonction PAR2 dans la modulation de l’inflammation aiguë à

antagoniser la voie iCa2 + et démontrer le potentiel

pour les modulateurs sélectifs des voies dans le contexte de la conception de médicaments GPCR.

Ces nouveaux ligands PAR2 offrent de nouveaux indices pour étudier les fonctions de PAR2

dans les voies de signalisation et dans les maladies inflammatoires.Figure 6Effets des composants

de 65 sur agoniste vs antagoniste

activité mesurée par la libération d’iCa2 + contre l’agoniste PAR2

2f-LIGRLO-NH2. HBA / HBD: accepteur de liaison hydrogène / donneur. RemerciementsWe

remercier le Conseil national de la santé et de la recherche médicale

d’Australie (NHMRC) pour une bourse principale de recherche principale

D.F. (1027369) et NHMRC (1047759, 1084083, 1083131) et l’Australien

Research Council (CE140100011) pour l’octroi de subventions.