Preuve de Méthanogènes Archaeal dans l’Abcès Cérébral

Preuve de Méthanogènes Archaeal dans l’Abcès Cérébral

Les méthanogènes sont des archaea anaérobies résistants aux antibiotiques qui échappent à la détection en microbiologie clinique Nous avons émis l’hypothèse que les méthanogènes font partie de la communauté anaérobie causant l’abcès cérébralMéthodesLes méthanogènes ont été étudiés dans un échantillon-index en utilisant une réaction en chaîne par polymérase spécifique. Dans un modèle murin, des PCR et des métagénomiques spécifiques à Archaea ont été utilisés pour détecter des séquences archéennes spécifiques dans des échantillons et des contrôles d’abcès cérébraux. le séquençage PCR ciblé et la métagénomique ont confirmé la présence de M oralis ainsi que de bactéries, y compris le S QPCR spécifique à l’Archaea de S intermedius, qui a donné des spécimens d’archaea dans / abcès cérébral et / des témoins P & lt; , et la métagénomique a donné des archaea, principalement des méthanogènes, dans des échantillons d’abcès cérébral, et aucune archaea dans les témoins négatifs P & lt; – L’infection des cerveaux de souris n’a donné aucune mortalité chez les témoins et la mort chez les souris inoculées par M oralis P & lt; -, / S souris intermédiaires inoculées P & lt; -, et / souris inoculées avec M oralis mélangé avec S intermedius P & lt; – jours après inoculationConclusionLes méthanogènes appartiennent à la communauté anaérobie responsable des abcès cérébraux, et M oralis peut participer à la pathogénicité de cette infection mortelle Chez la souris, une synergie de M oralis et S intermedius a été observée. Le traitement antibiotique de l’abcès cérébral doit contenir des anti-archaïques. des composés tels que les dérivés d’imidazole dans la plupart des cas

abcès cérébral, méthanogène, Methanobrevibacter oralis, microbiologie, cultureL’abcès cérébral reste une infection grave, avec une mortalité qui est tombée de% -% dans les séries plus anciennes à environ% dans les séries plus récentes chez les patients ayant bénéficié de tomodensitométrie, drainage chirurgical, et combinaisons, des antibiotiques La gestion des patients diagnostiqués avec un abcès cérébral est guidé par l’identification correcte des organismes pathogènes Avances récentes dans la recherche moléculaire de l’abcès cérébral, y compris le séquençage du S ARNr multiple et la métagénomique , a élargi régulièrement le répertoire des bactéries détectées dans les abcès cérébraux par des replis et des replis révélant des pathogènes émergents tels que les mycoplasmes. Cependant, ces techniques ont négligé les méthanogènes, qui sont des procaryotes résistants aux antibiotiques qui échappent à la détection systématique en microbiologie clinique. laboratoires Ils sont des organismes très exigeants cultivés dans une atmosphère d’hydrogène e et ils résistent à la détection systématique des gènes ARNr S Des méthanogènes ont récemment été détectés dans le microbiote humain associé aux muqueuses buccale, intestinale et vaginale Le méthanogène Methanobrevibacter oralis a été impliqué dans l’infection parodontale , mais Son rôle de pathogène reste à éclaircir Récemment, nous avons développé des techniques spécifiques de détection et de culture dans la recherche de méthanogènes pathogènes Nous avons supposé que les méthanogènes, qui sont des anaérobies stricts du microbiote oral, pouvaient être détectés dans des tissus infectés par des bactéries anaérobies buccales, Par conséquent, nous avons étudié minutieusement la présence de méthanogènes dans un spécimen d’abcès cérébral en utilisant des techniques orientées méthanogènes pour confirmer la présence de méthanogènes pathogènes vivants dans l’abcès cérébral. Nous avons ensuite utilisé la métagénomique neutre comme seconde. technique de détection de ligne dans une série plus largeLe comité d’éthique de l’Institut Fédératif de est l’étude

Méthodes

Les patients

Un cas d’abcès cérébral avec une quantité suffisante de matériel d’abcès a été soigneusement étudié. Ce spécimen d’abcès cérébral a été prélevé par ponction stéréotaxique chez une femme âgée d’un an et présentant une avulsion dentaire présentant une confusion fébrile et une lésion thalamique gauche. L’examen cytopathologique de la lésion cérébrale a révélé une inflammation lymphocytaire et monocytaire sans cellules polymorphonucléaires ou malignes. Détection du gène de l’ARNr de la souche S retrouvée chez Porphyromonas endodontalis, avec une anomalie de l’arthrite rhumatoïde non traitée. % de similarité avec la séquence de référence GenBank, NR_ et Streptococcus intermedius a été documentée en utilisant une réaction en chaîne de la polymérase en temps réel RT-PCR et cultivée. Le patient a répondu à des semaines de traitement quotidien incluant le ceftriaxone g et le métronidazole. -up, le patient n’a montré aucune preuve l’infection et ses troubles cognitifs s’amélioraient

Séquençage PCR

Archaea S gènes ARNr et mcrA ont été amplifiés par PCR dans l’échantillon cérébral du patient index, comme décrit précédemment , en présence de contrôles négatifs qui consistaient pathologiquement évalués, biopsies cérébrales en culture anaérobie échantillonnées chez des patients atteints de maladies cérébrales autres que le cerveau les produits de PCR d’abcès ont été purifiés à l’aide du kit NucleoFast PCR Macherey-Nagel, Hoerdt, France, et les réactions de séquençage ont été réalisées à l’aide du Big-Dye Terminator, version, kit de séquençage cyclique ADN Perkin-Elmer, Villebon sur Yvette instructions du fabricant Tous les produits de la PCR ont été séquencés, et les différents fragments ont été assemblés en utilisant le logiciel ChromasPro et comparés à la base de données GenBank en utilisant le programme en ligne BLAST du Centre national d’information sur la biotechnologie NCBI

Isolement et culture

A -μL volume de l’échantillon d’abcès cérébral du patient de l’index a été cultivé dans un tube Hungate qui contenait ml de milieu méthanogène anaérobe complété avec mg / L d’imipénème, mg / L de vancomycine, et mg / L amphotéricine B Ceci a ensuite été incubé en utilisant un mélange On a prélevé 20 colonies à l’aide d’une pipette Pasteur stérile pour effectuer le séquençage du génome. La sensibilité in vitro de l’isolat méthanogène a été déterminée pour le métronidazole, l’acide fusidique, le chloramphénicol et la ceftriaxone, comme décrit précédemment

Séquençage du génome

L’ADN génomique de l’isolat de M oralis fabriqué à partir du spécimen d’abcès cérébral a été séquencé à l’aide de la technologie MiSeq Illumina, Inc., San Diego, Californie avec une stratégie appariée et code-barres pour être mélangé avec d’autres projets construits selon le Nextera Un échantillon de l’ADN génomique a été fragmenté par l’étape de « tagmentation », et les fragments ont été marqués avec un adaptateur de jonction et des codes-barres à double index avec une PCR limitée. Ensuite, une amplification PCR limitée a complété les adaptateurs Les bibliothèques ont ensuite été normalisées sur des billes spécifiques selon le protocole Nextera XT Illumina, regroupées en une seule bibliothèque, puis chargées sur la cartouche de réactifs La génération automatisée de grappes et le séquençage à paire avec lectures d’index doubles ont été réalisés en une seule heure courant dans un × bp L’information totale de Gb a été obtenue à partir d’une densité de clusters K / mm avec% grappes de la qualité de passage des clusters filtres de contrôle Au sein de cette analyse groupée, la représentation de l’index de M oralis a été déterminée à%. Les lectures couplées ont été filtrées en fonction des qualités lues

Pcr en temps réel

L’ADN a été extrait de l’échantillon de pus prélevé chez le patient index, ainsi que du pus provenant d’échantillons d’abcès cérébraux collectés chez des patients supplémentaires avec un abcès cérébral acquis en présence de témoins négatifs anaérobies et pathologiquement évalués. Les contrôles négatifs étaient des biopsies cérébrales prélevées sur patients avec une infection monomicrobienne n = et avec des maladies autres que l’abcès cérébral n =; Tableau supplémentaire L’ADN extrait a été incorporé dans la RT-PCR aveugle, ciblant M oralis, comme décrit précédemment Une autre RT-PCR a détecté Methanobrevibacter smithii en ciblant un tableau supplémentaire de régions répétées en utilisant la paire d’amorces suivante: M smithii-F ‘-ACCATAACyATCAGCAGCATTAT-‘ et M smithii-R ‘-AGTATTGGTGAAGGATTTaCTGT-‘ Eurogentec, Seraing, Belgique, et la sonde M smithii -carboxyfluorescéine [FAM] – ‘ACCyTTATCAGCTTTACCATTAATyAAAG-‘ Biosystèmes Appliqués, Courtaboeuf, France dans les conditions de PCR suivantes: ° C pour minutes, suivi de cycles de ° C pour la seconde, ° C pour la seconde, et ° C pour la seconde La spécificité de l’amorce et de la sonde M smithii a été vérifiée in silico en utilisant le programme BLAST au NCBI http: // wwwncbinlmnihgov / BLAST La spécificité était également expérimentalement assurée par incorporant de l’ADN extrait de bactéries et de l’ADN extrait de Methanosphaera stadtmanae ATCC T, Methanomassiliicoccus luminyensis CSURPT, et M oralis DSMZ T Huit négatifs cont Les tests RT-PCR ont tous été réalisés en utilisant un système de détection CFX Touch RT-PCR Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France et le kit PCR MasterMix Eurogentec avec pmol de chaque amorce et sonde et μL d’environ μg d’ADN dans un volume final de -μL La RT-PCR a été considérée comme positive pour tout seuil de cycle Valeur Ct & lt; Les résultats ont été exprimés en nombre de copies du gène M oralis et M smithii

Analyses métagénomiques

L’ADN total a été extrait du pus prélevé sur le patient index et d’échantillons d’abcès cérébraux recueillis sur une série rétrospective additionnelle de patients diagnostiqués avec un abcès cérébral acquis et post-chirurgical. Ces patients supplémentaires étaient d’origine européenne et âgés de plusieurs jours à Les échantillons d’abcès cérébraux ont été envoyés à notre laboratoire et conservés à – ° C L’extraction de l’ADN a été réalisée à l’aide de l’automate EZ Advanced XL et du kit DNA Tissue conformément aux instructions du fabricant Qiagen, Hilden, Allemagne stimulant. Qubit assay Life Technologies, Carlsbad, Californie Ces échantillons ont été séquencés avec la technologie MiSeq Illumina en utilisant la stratégie appariée Le séquençage a été effectué comme décrit ci-dessus L’analyse bioinformatique a été réalisée en utilisant le pipeline MetAMOS V. Les lectures de mauvaise qualité ont été filtrées via FastQC http: // wwwbioinformaticsbabrahamacuk / projects / fastqc / L’assemblage de la séquence était p erformed with Velvet software FragGeneScan permet de rechercher des cadres de lecture ouverts dans les séquences assemblées L’annotation taxonomique a été faite par le paquetage de classification des fragments Tous les autres paramètres MetAMOS ont été conservés par défaut

Modèle expérimental de la souris de Methanobrevibacter oralis Infection cérébrale

L’infection expérimentale de la souris a été réalisée en utilisant les isolats M oralis et S intermedius cultivés à partir de l’abcès cérébral du patient index. Les souris ont été manipulées selon les règles du décret N ° – Février de France et le protocole expérimental APAFIS a été approuvé par le Comité d’Ethique Le CEA de l’Université d’Aix-Marseille en France et le Ministère de l’Education Nationale, de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche ont été hébergés dans un établissement spécifique et nourris de nourriture stérile et d’eau ad libitum Quatre groupes de souris nouveau-nés ont été utilisés. en double exemplaire Le groupe témoin a été inoculé par voie intracérébrale avec un volume -μL contenant du tampon phosphate stérile, et le groupe expérimental avec des unités formant des colonies CFU S intermedius, CFU M oralis, ou – CFU S intermedius mélangé avec CFU M oralis souris ont été observés tous les jours pendant des jours pour tous les signes d’inconfort ou de détresse, et la mortalité a été notée Les animaux survivants ont ensuite été euthanasiés, et le cerveau Chaque échantillon a été conservé à – ° C pour M oralis quantitatif q PCR et isolement L’ADN total extrait comme décrit ci-dessus a servi de matrice pour qPCR en utilisant la RTBR PCR verte QMiR Qiagen avec pmol de chaque mcrA-F Les amorces ‘-GGTGGTGTMGGATTCACACARTAYGCWACAGC-‘ et mcrA-R ‘-TTCATTGCRTAGTTWGGRTAGTT-‘ et μL d’ADN dans un volume final de -μL cerveau de souris inoculé avec μL de M oralis comme contrôle positif et contrôle d’extraction négatif ont été inclus dans chaque plaque de réaction. comme le nombre de copies / spécimens du gène M oralis Le programme de PCR était ° C pendant minutes, suivi par des cycles de ° C pour deuxième, ° C pour deuxième, et ° C pour deuxième Une courbe d’étalonnage a été créée en mesurant la valeur Ct d’un dilution en série de M oralis comme contrôle positif

RÉSULTATS

Investigations de laboratoire du patient index avec l’abcès cérébral

Dans le pus d’abcès cérébral soigneusement étudié recueilli chez le patient index, RT-PCR a donné des copies / spécimens du gène M oralis, E et aucun M smithii, tandis que les contrôles négatifs sont restés négatifs. Dans ce spécimen, le séquençage PCR a donné une séquence du gène S rRNA. similitude de séquence avec le numéro de référence M oralis GenBank HE, et le séquençage PCR du gène mcrA présentant% de similarité de séquence avec le numéro de référence M oralis GenBank DQ, alors que les contrôles négatifs restaient négatifs Les séquences des différents gènes rapportés ici ont été déposé dans les numéros d’accès GenBank LN et LN La culture dans l’atmosphère aérobie est restée stérile, mais la culture dans des conditions anaérobies utilisant une plaque de gélose au sang enrichie en molécules d’antioxydants acide ascorbique, g / L; acide urique, g / L; et glutathion, g / L a produit S intermedius, identifié par spectrométrie de masse MALDI-TOF-MS laser désorption / ionisation assistée par matrice avec des scores de et, respectivement en présence de témoins négatifs qui sont restés stériles, la culture du pus dans le milieu SAB, comme décrit précédemment , a généré du méthane en semaines et la sous-culture a donné des colonies en semaines Le séquençage complet du génome de l’isolat a confirmé l’identification de M oralis, avec% de similarité de séquence génomique avec le génome de référence. L’isolat, cultivé en présence de mg / L d’imipénème, de mg / L de vancomycine et de mg / L d’amphotéricine B dans le milieu SAB, était sensible in vitro à la concentration minimale inhibitrice du métronidazole [MIC] ≤ mg / L et à l’acide fusidique MIC ≤ mg / L et résistant au chloramphénicol MIC ≥ mg / L et à la ceftriaxone MIC, mg / L

Pcr en temps réel

Dans une collection d’échantillons d’abcès cérébraux, la RT-PCR a détecté M oralis dans /% spécimens, avec un nombre moyen de copies / spécimens de E ± E, et M smithii dans /%, avec un gène copies / spécimen de E dans le groupe témoin , les mêmes expériences ont détecté M oralis dans /% spécimens, avec un nombre moyen de copies / spécimens de E ± E et non M smithii La différence de prévalence de M oralis entre le groupe témoin et le groupe abcès cérébral était significative P & lt; ; In, En particulier, les patients atteints d’un abcès cérébral présomptif monomicrobien étaient négatifs pour les archées par RT-PCR

Analyses métagénomiques d’une série d’abcès cérébraux

Après le séquençage MiSeq, le nombre moyen de lectures était c reads / patient La taille des lectures variait de pb à pb Les lectures appartenant aux archées étaient retrouvées chez tous les patients, alors que les témoins négatifs donnaient Halomonas spp%, Shewanella algae%, espèces bactériennes diverses, Excepté Homo sapiens, la proportion de lectures appartenant à des bactéries était de% ±%% -%, et la proportion de lectures appartenant à des virus était de% ±%% -% Les lectures d’archéobactéries se trouvaient dans / échantillons, y compris le patient indexé spécimen; la proportion de lectures appartenant aux archées était de% ±%,% -% dans les abcès cérébraux d’origine traumatique,% ±%,% -% d’origine dentaire,% ±% gamme,% -% d’origine du cancer,% ±% plage,% -% liée à une bactériémie, et% ±% intervalle,% -% dans les abcès cérébraux post-chirurgicaux Lit appartenant aux archées représenté% chez les patients atteints d’otite,% chez les patients atteints de maladie de Rendu-Osler, et% chez les patients sinusite En revanche, aucune lecture archéenne n’a été trouvée dans les échantillons de plasma et de sérum, les biopsies des ganglions lymphatiques, le liquide péricardique et les échantillons de liquide oculaire en utilisant un% de similarité de séquence de coupure P & lt; -; ph, Le phylum Euryarchaeota représentait la majorité des lectures archéennes% Les genres les plus représentés étaient Methanothermobacter, Methanobrevibacter et Methanobacterium, et Methanothermobacter thermoautotrophicus et Methanothermobacter marburgensis étaient les espèces les plus communes Tableau supplémentaire

Modèle de souris

Sept jours après l’inoculation, l’infection expérimentale des cerveaux de souris n’a donné aucune mortalité chez les souris témoins inoculées avec le tampon, alors que les souris inoculées avec /% M orales sont mortes P & lt; -, /% S souris inoculées par des intermédiaires sont mortes P & lt; -, et /% souris inoculées avec M oralis mélangé avec S intermedius sont mortes P & lt; – La mortalité chez les souris co-infectées avec M oralis et S intermedius était significativement plus élevée que la mortalité chez les souris inoculées avec S intermedius seul P & lt; – La culture du foie et de la rate n’indique aucune production de méthane, mais des tubes ensemencés avec des cerveaux de souris inoculés avec M oralis produisent du méthane gazeux. Le méthanogène est identifié comme M oralis sur la base d’un ARNm% S et de la oralis Les mêmes tubes cultivés S intermedius après une incubation d’une journée sur gélose de Colombie% de sang de mouton à ° C dans des conditions anaérobies; l’isolat a été identifié par MALDI-TOF-MS Dans toutes les expériences basées sur la PCR, les contrôles négatifs sont restés négatifs, alors que le plasmide de quantification introduit comme contrôle interne pour contrôler l’absence d’inhibition de la PCR a donné des amplifications positives en% des échantillons. souris, les quantifications par PCR du gène mcrA spécifique aux méthanogènes ont montré un nombre moyen de cellules de E ± E Ct, ±, alors qu’aucune archaea n’a été détectée chez les souris inoculées avec du tampon phosphate stérile ou S intermedius seulement

DISCUSSION

Nous montrons que les archées font partie du microbiote responsable de certains cas d’abcès cérébral. Ce fait a été confirmé par plusieurs preuves, notamment la détection RT-PCR de M oralis avec une prévalence plus élevée chez les patients que chez les témoins, incluant les cas de cerveau monomicrobien abcès; la détection métagénomique des archées dans les spécimens d’abcès cérébraux de tous les patients étudiés; et l’observation directe de M oralis dans un spécimen de cerveau indexé par RT-PCR, séquençage PCR, et isolement en coculture avec S intermedius. Par conséquent, les données métagénomiques indiquent que les archées forment% -% du microbiote de l’abcès cérébral. Euryarchaeota% et Crenarchaeota%, les organismes les plus représentés appartenant aux espèces méthanogènes M thermoautotrophicus et M marburgensis Le fait que nous n’ayons pas détecté de lectures d’archées dans une série récemment examinée de spécimens de tissus et de biopsies dans notre laboratoire renforce la spécificité de la métagénomique Etant donné que tous les patients étudiés dans cette série étaient d’origine européenne, la prévalence et la nature des méthanogènes dans l’abcès cérébral détectés ici peuvent ne pas refléter celles observées dans cette série. dans d’autres contextes géographiques, et d’autres séries devraient être étudié dans d’autres centres de référenceArchaea n’ont pas été précédemment détectés dans les spécimens cérébraux parce qu’ils sont des organismes fastidieux qui ne poussent pas en utilisant des protocoles de routine dans le laboratoire de microbiologie et ne sont pas amplifiés par des tests de S-PCR. gène de l’ARNr S bactérien PCR, clonage et séquençage des archées négligées [,,] Les données métagénomiques concordent avec l’isolement et la culture de M oralis, un méthanogène dans la cavité buccale et également isolé du tube digestif Cet isolat a été clairement identifié après séquençage de son génome complet Le modèle murin indique que M oralis seul est responsable d’une mortalité aiguë significativement plus élevée que les témoins Cette observation suggère que M oralis seul est pathogène pour le tissu neural En effet, M oralis produit du méthane, un gaz neurotoxique puissant , suggérant les méthanogènes peuvent participer à la pathogénicité des lésions cérébrales en partie par neurona l toxicitéL’isolat de cerveau de Malisalis étudié ici était résistant à la ceftriaxone, à l’imipénem et à la vancomycine, qui sont couramment utilisés pour traiter les abcès cérébraux Ce modèle de résistance concorde avec les données de sensibilité in vitro qui indiquent que les méthanogènes sont largement résistants aux antibiotiques. de nombreux agents ont souvent été prescrits comme traitement empirique des abcès cérébraux Cependant, cet isolat était sensible au métronidazole, ce qui est en accord avec les données précédemment publiées Le métronidazole a révolutionné le pronostic des abcès cérébraux. En effet, une partie de l’efficacité clinique du métronidazole peut aussi être due à son activité puissante contre les méthanogènes. Dans les séries rapportées ici, la seule mort enregistrée était celle d’un patient infecté par M smithii n’ayant pas reçu de métronidazole.

CONCLUSIONS

Ces données suggèrent que, compte tenu de l’implication probable des méthanogènes dans les abcès cérébraux, le traitement médical des abcès cérébraux doit incorporer des agents actifs contre ces microorganismes, tels que les dérivés de l’imidazole

Données supplémentaires

Les documents supplémentaires sont disponibles sur Clinical Infectious Diseases en ligne. Les données fournies par les auteurs étant destinées au lecteur, les documents publiés ne sont pas copiés et relèvent de la seule responsabilité des auteurs. Les questions ou les commentaires doivent donc être adressés à l’auteur correspondant.

Remarques

Soutien financier VDN a reçu un doctorat de l’IHU Méditerranée Infection, Marseille, France Ce travail a été financé par l’Unité de recherche sur les maladies infectieuses et tropicales émergentes, Marseille, France Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: Aucun conflit d’intérêts signalé Tous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Les conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués