Prévalence des mutants de la dihydroptéroate synthase chez les enfants sud-africains infectés par le VIH atteints de pneumonie à Pneumocystis jiroveci

Prévalence des mutants de la dihydroptéroate synthase chez les enfants sud-africains infectés par le VIH atteints de pneumonie à Pneumocystis jiroveci

Contexte Pneumocystis jiroveci anciennement pneumonie à Pneumocystis carinii La PCP est une cause majeure de mortalité chez les nourrissons infectés par le VIH en Afrique, mais la prévalence des mutations du gène codant pour la dihydroptéroate synthase DHPS chez les isolats d’Afrique n’a pas été rapportée. de mutations de DHPS dans des isolats de P jiroveci d’enfants sud-africains infectés par le VIH avec PCP en amplifiant l’ADN en utilisant différentes réactions en chaîne par polyméraseRésultats L’ADN de P jiroveci provenant d’échantillons respiratoires a été amplifié; Les échantillons contenant des mutations de DHPS sauvages contenaient une population homogène avec des mutations simples de DHPS, contenaient une population homogène avec des mutations DHPS, et le quatrième contenait une population hétérogène d’organismes avec des types sauvage et unique. génotypes DHPS mutants Seul un enfant recevait une prophylaxie au triméthoprime-sulfaméthoxazole TMP-SMZ; ce patient était infecté par Pjiroveci de type sauvage Le taux de mortalité global, [%] des enfants n’était pas significativement différent entre les enfants infectés par Pjiroveci [%] de type sauvage de et ceux infectés avec des souches mutantes [%] de; P = Conclusions Les mutations DHPS sont rares dans les isolats de P jiroveci d’Afrique du Sud Cependant, l’utilisation croissante de la prophylaxie TMP-SMZ peut entraîner un développement généralisé des mutations

Pneumocystis jiroveci anciennement pneumonie à Pneumocystis carinii Le PCP est de plus en plus souvent cité comme une cause importante d’hospitalisation et de décès chez les nourrissons infectés par le VIH en Afrique Des études postmortem ont détecté le PCP chez% -% des enfants africains séropositifs. ] Dans une grande étude récente sur l’autopsie d’enfants zambiens morts de causes respiratoires, P jiroveci, qui a été trouvé dans% des cas, était la cause la plus fréquente de décès chez les nourrissons infectés par le VIH & lt; mois d’âge; Les études africaines prospectives ont confirmé que P jiroveci est une cause importante de pneumonie sévère chez les nourrissons infectés par le VIH Dans une étude prospective visant à étudier l’étiologie et l’issue de la pneumonie acquise dans la communauté chez les nourrissons infectés par le VIH. Les enfants sud-africains admis dans un hôpital de soins tertiaires, le PCP était la maladie définissant le SIDA chez% des enfants infectés par le VIH; le taux de mortalité parmi ceux ayant un PCP% était beaucoup plus élevé que parmi ceux sans PCP% Parmi les enfants malawiens infectés par le VIH hospitalisés avec une pneumonie sévère,% avaient une PCP Une étude sud-africaine des enfants infectés par le VIH a identifié P jiroveci en% des cas de pneumonie sévère Triméthoprime-sulfaméthoxazole TMP-SMZ est le principal agent de choix pour la prophylaxie et le traitement de la PCP L’activité contre la pneumocystose est principalement due au composant sulfaméthoxazole, qui inhibe la dihydroptéroate synthase DHPS La prophylaxie n’a pas été largement utilisée dans Les pays africains en raison des difficultés à identifier les nourrissons infectés par le VIH périnatalement, le manque de ressources pour mettre en œuvre une prophylaxie généralisée, et le souci de développer une résistance aux antimicrobiens contre TMP-SMZ Néanmoins, TMP-SMZ est largement disponible, abordable, et efficace pour prévenir la PCP, comme l’ont montré des comparaisons historiques de l’incidence de la PCP avant l’avènement de la prophylaxie [ Il a été rapporté que l’utilisation de la prophylaxie contre le PCP diminue le risque et la gravité de cette maladie chez les nourrissons africains infectés par le VIH Une étude réalisée au Cap, en Afrique du Sud, a montré que la prophylaxie TMP-SMZ était associée à une protection significative. contre le PCP, parce que seulement% des enfants qui ont reçu une prophylaxie ont développé le PCP, comparé au% de ceux qui n’ont pas reçu le risque relatif de prophylaxie; % CI, -; P = L’utilisation de la prophylaxie TMP-SMZ a également été associée à un taux de mortalité plus faible chez les enfants infectés par le VIH hospitalisés avec une pneumonie, par rapport à ceux n’ayant pas reçu de prophylaxie . l’utilisation de la prophylaxie TMP-SMZ chez tous les nourrissons exposés au VIH âgés de quelques semaines à plusieurs mois et chez les enfants et les adultes infectés par le VIH cliniquement symptomatiques ou chez ceux présentant une immunosuppression sévère, c.-à-d. On peut s’attendre à une utilisation plus répandue de la prophylaxie TMP-SMZ étant donné que ces lignes directrices sont appliquées dans les pays africains. Des mutations dans le gène P jiroveci codant pour DHPS ont été signalées de plus en plus fréquemment dans les isolats des pays développés, en association avec une prophylaxie TMP-SMZ. ] Les mutations DHPS les plus fréquentes rapportées sont un changement d’acides aminés aux positions de la thréonine à l’alanine et de la proline à la sérine Des études ont montré que les souches mutantes sont associées à l’échec de la prophylaxie TMP-SMZ Une augmentation du taux de mortalité associée à la présence de mutations DHPS dans les cas de PCP a été rapportée. Cependant, aucune corrélation entre traitement spécifique, mutations DHPS et issue n’a été décrite. Comme l’utilisation de la prophylaxie TMP-SMZ est en augmentation dans les pays africains et que la majorité des personnes infectées par le VIH en Afrique réside dans la région subsaharienne, il devient de plus en plus important de surveiller la présence d’isolats mutants de P jiroveci en Afrique. développement et prévalence des souches mutantes dans cette zone géographique Le but de cette étude était d’étudier la prévalence des mutations DHPS dans les isolats de P jiroveci d’enfants infectés par le VIH hospitalisés avec PCP au Cap

Méthodes

Une étude prospective d’isolats de P jiroveci provenant d’enfants infectés par le VIH admis pour PCP sur une période d’un an à l’hôpital Red Cross Childrens, Université du Cap, Afrique du Sud, a été réalisée. Les enfants admis à l’hôpital présentaient des signes cliniques. échantillons obtenus pour le diagnostic Traitement avec un régime standard de TMP-SMZ mg / kg dose de charge de PTM, suivi de mg / kg qh et de corticostéroïdes mg / kg de prednisone pendant plusieurs jours, puis mg / kg pendant plusieurs jours, suivi de mg / kg Des échantillons d’expectorations induites ou de lavage broncho-alvéolaire non dirigé ont été obtenus pour la détection immunofluorescente de P jiroveci, comme décrit ailleurs Des échantillons avec des résultats d’immunofluorescence positifs ont été granulés, placés dans de l’éthanol et livrés à l’Université de Caroline du Nord. analyse L’étude a été approuvée par les comités de recherche et d’éthique de l’Université du Cap et de l’Université de Caroline du Nord – Chapelle H Le kit d’extraction d’ADN QIAamp Qiagen a été utilisé pour extraire l’ADN du culot obtenu après centrifugation des échantillons d’expectoration ou de BAL. L’ADN a été amplifié par PCR dans un contrôleur thermique programmable MJ Research utilisant un protocole de PCR nichée, [2] On a utilisé la même série d’amorces, chacune avec des programmes différents dans le thermocycleur, avec les deux polymérases. Au cours de la première série de PCR, les amorces F ‘ont été utilisées avec la polymérase recombinante classique Taq ADN polymérase Invitrogen et la nouvelle génération HotStar Taq polymérase Qiagen. -CCTGGTATTAAACCAGTTTTGCC- ‘et B’ -CAATTTAATAAATTTCTTTCCAAATAGCATC- ‘ont été utilisées Au second tour, les amorces étaient AHUM’ -GCGCCTACACATATTATGGCCATTTTAAATC- ‘et BN’ -GGAACTTTCAACTTGGCAACCAC- ‘Les mélanges PCR contenaient une matrice d’ADN μL, des amorces umol / L chacune, dNTPs mmol / L, et MgCl mmol / L si Taq ADN polymérase U a été utilisé, mais pas MgCl si HotStar Taq polymérase U a été utilisé, ainsi que le tampon de réaction chaque poly la mérase a son propre tampon et de l’eau, ce qui donne un volume total de μL Lorsque l’ADN polymérase Taq recombinante est utilisée, les réglages du thermocycleur pour le premier cycle sont: dénaturation à ° C pendant min, suivie de cycles à ° C pendant s, ° C pour s et ° C pour s, et une étape de terminaison à ° C pour les réglages du thermocycleur min pour le second tour étaient ° C pour min, suivi par des cycles de ° C pour s, ° C pour s, et ° C pour s, et une étape de terminaison Les mêmes conditions ont été utilisées lorsque la HotStar Taq polymérase a été utilisée, sauf que l’étape de dénaturation initiale pour les deux premiers tours était de ° C pendant min au lieu de ° C pour les contrôles positifs minFor, les échantillons BAL obtenus à partir du VIH- Des échantillons infectés par le PCP et des séquences DHPS connues ont été utilisés, tandis que des échantillons de BAL obtenus de patients infectés par le VIH sans PCP ont été utilisés comme témoins négatifs. Pour l’analyse des fragments générés par PCR, on a examiné μL de chaque produit d’amplification PCR par électrophorèse. % d’agar des gels pour une bande de pb correspondant à la taille du gène P jiroveci codant DHPS L’ADN de la bande de gel d’agarose a été purifié avec le kit d’extraction de gel QIAquick Qiagen, selon les instructions du fabricant. Les fragments PCR ont été séquencés sur un séquenceur d’ADN automatisé modèle ABI; Applied Biosystems, utilisant les amorces décrites ci-dessus Les analyses de séquences ont été réalisées en utilisant Chromas Technelysium Pty Ltd, ClustalX, et GeneDoc éditeur d’alignement de séquences multiples, version, et les résultats ont été comparés avec la séquence de type sauvage pour le gène P jiroveci. analysé à l’aide d’Epi Info, version Centres pour le contrôle et la prévention des maladies La mortalité chez les enfants infectés par Pjiroveci de type sauvage a été comparée à celle des enfants infectés par des souches mutantes en utilisant le test χ

Résultats

Les résultats de l’immunofluorescence pour le PCP étaient positifs pour les échantillons respiratoires obtenus à partir d’enfants infectés par le VIH. Parmi ceux-ci, les échantillons ont été amplifiés en utilisant des ensembles de protocoles de PCR Parmi les enfants,% étaient des hommes; l’âge moyen était de plusieurs mois, mois Seul un enfant prenait une prophylaxie TMP-SMZ, car l’infection à VIH n’avait pas été diagnostiquée auparavant chez les autres poussée dentaire. Chez les enfants%, la PCP était la maladie qui présentait un diagnostic d’infection par le VIH. % des patients ont été infectés par P jiroveci avec des allèles DHPS de type sauvage, alors que les échantillons% contenaient des mutations DHPS. Le tableau 3 contenait des isolats homogènes de P jiroveci – le premier contenait une double mutation en DHPS consistant en: d’un changement à l’acide aminé et un changement à l’acide aminé, le deuxième avait un polymorphisme unique à l’acide aminé, et le troisième a contenu un changement à l’acide aminé Un échantillon a contenu une population hétérogène d’isolats de P jiroveci consistant en une souche sauvage et une souche avec une seule mutation à l’acide aminé

Tableau View largeTélécharger slidePneumocystis jiroveci dihydropteroate synthase génotypes chez les enfants africains infectés par le VIH avec pneumonie P jiroveciTable View largeTélécharger slidePneumocystis jiroveci dihydroptéroate synthase génotypes chez les enfants africains infectés par le VIH avec pneumonie P jiroveciTingt enfants sont morts pendant l’hospitalisation, y compris l’enfant célibataire recevant une prophylaxie TMP-SMZ Le taux de mortalité chez les enfants infectés par P jiroveci [%] d’enfants de type sauvage n’était pas significativement différent, comparé à ceux infectés par des souches mutantes [%] d’enfants P =

Discussion

évalence des mutations P jiroveci DHPS en Afrique La plupart des cas de PCP chez les enfants sud-africains ont été causés par P jiroveci de type sauvage, mais les mutations DHPS aux codons et qui peuvent être responsables d’une faible résistance aux médicaments contenant du soufre sont survenues en minorité. Ceci est en contraste avec les rapports des États-Unis, où la prévalence des mutations de DHPS rapportées chez les patients atteints de SIDA et de PCP est de% -% La faible prévalence de mutant P jiroveci observée dans notre étude peut être en raison de l’absence d’exposition à la prophylaxie TMP-SMZ chez presque tous les enfants. En outre, TMP-SMZ est rarement utilisé pour le traitement de maladies infantiles autres que le PCP en Afrique du Sud en raison des niveaux élevés de résistance antimicrobienne à ce médicament. Un antibiotique β-lactame ou une céphalosporine, plutôt que du TMP-SMZ, serait le médicament préféré pour le traitement de la pneumonie infantile, de l’otite moyenne ou d’autres infections bactériennes courantes et, par conséquent, la majorité des enfants Les études menées aux États-Unis indiquent que le développement de mutations du DHPS est plus fréquent chez les patients infectés par le VIH qui ont reçu une prophylaxie au soufre, qui est lié à la durée de la prophylaxie et qui a augmenté au fil du temps chez les patients infectés par le VIH. association avec une plus grande utilisation de la prophylaxie TMP-SMZ L’apparition de mutations chez les enfants qui n’avaient pas reçu de prophylaxie TMP-SMZ antérieure peut éventuellement être attribuée à une primo-infection acquise chez une personne infectée par une souche mutante. rapport décrit une transmission probable de la pneumocystose de mère à enfant De plus, des souches mutantes ont été découvertes de plus en plus fréquemment chez des personnes infectées par le VIH aux États-Unis qui n’ont pas reçu de prophylaxie . parce que nous n’avons pas pu obtenir d’informations cliniques ou d’échantillons de mères ou de contacts proches d’enfants dans notre étude. Cette situation est compatible avec les mauvais résultats signalés chez les enfants infectés par le VIH atteints de PCP dans les pays en développement La mortalité n’a pas pu être attribuée à la résistance à la TMP-SMZ chez les enfants des pays en développement. En outre, la signification clinique des mutations DHPS aux positions et n’est pas claire. L’échec de la prévention de la PCP chez les patients recevant une prophylaxie TMP-SMZ et une infection par P jiroveci suggère que de telles mutations peuvent conférer un faible niveau de résistance suffisant pour surmonter l’effet inhibiteur de la prophylaxie. Cependant, l’effet des souches mutantes sur la maladie clinique et l’issue du PCP est controversé, et l’efficacité du traitement TMP-SMZ à forte dose peut varier Quelques études ont rapporté un résultat similaire chez les patients infectés par le VIH avec PCP de type sauvage et mutant, tandis que d’autres s ont trouvé que les patients infectés par des souches mutantes réagissent moins bien au traitement [,,] En outre, dans notre étude, une erreur de type peut avoir eu lieu en raison de la petite taille de l’échantillon. Une prophylaxie par la TMP-SMZ peut réduire considérablement l’incidence de la PCP [, -], en particulier dans les pays pauvres en ressources où relativement peu de personnes infectées par le VIH ont accès à la multithérapie. La prophylaxie TMP-SMZ peut réduire significativement la morbidité et la mortalité dues à d’autres infections bactériennes La mortalité élevée associée à l’infection pneumocystique primaire chez les enfants et l’émergence du PCP comme infection de plus en plus importante chez les patients africains indiquent que Les nourrissons et l’utilisation de la prophylaxie TMP-SMZ devraient être une priorité Cependant, comme la prophylaxie TMP-SMZ est de plus en plus utilisée, De plus, des études menées dans des pays développés suggèrent que la transmission de la pneumocystose d’un individu à un autre peut se produire. Ainsi, à mesure que la prévalence des souches mutantes augmente, le risque d’infection primaire par le VIH augmente. La surveillance continue du développement des souches mutantes de P jiroveci dans les pays africains devient donc de plus en plus importante et peut aider à élucider les mécanismes responsables du développement de la résistance et des implications cliniques associées. Les mutations de rares chez les enfants infectés par le VIH au Cap Les mutations du DHPS au niveau des codons et qui peuvent être responsables d’une faible résistance au traitement contenant du soufre commencent seulement à s’accumuler. Cependant, l’utilisation accrue de la prophylaxie par TMP-SMZ peut entraîner dans le développement plus répandu des mutations; une surveillance continue de cette situation est nécessaire

Remerciements

Nous remercions Patti Apolles pour son aide à la collecte de spécimens et de données, le personnel de l’hôpital pour enfants de la Croix-Rouge du Cap en Afrique du Sud pour le prélèvement d’échantillons et le personnel du laboratoire de microbiologie pour le traitement des spécimens. et les Instituts nationaux de la santé accordent le RO AI, pour les analyses du PCR MJA-M a reçu une subvention de recherche du Fonds pour l’amélioration de l’éducation postsecondaire EspagneConflit d’intérêt Tous les auteurs: Pas de conflit