Résistance aux macrolides et types moléculaires de Treponema pallidum causant la syphilis primaire à Shanghai, Chine

Résistance aux macrolides et types moléculaires de Treponema pallidum causant la syphilis primaire à Shanghai, Chine

Contexte La résurgence de la syphilis en Chine nécessite des laboratoires pour mettre à jour leurs méthodes d’investigation et de surveillance épidémiologique moléculaire. Cette étude porte sur la mise en œuvre de tests de PCR en chaîne par polymérase pour la syphilis et la détection des sous-types moléculaires et de la résistance aux macrolides. Shanghai, ChinaMethods Les écouvillons ont été obtenus à partir des lésions génitales des patients présentant des symptômes compatibles avec la syphilis primaire Huit des patients ont également fourni des échantillons de sang total Des écouvillons ont également été obtenus chez des patients sans syphilis présentant des ulcérations génitales PCR pour amplifier le tréponème commun mais non lié les gènes ont été réalisés sur des échantillons d’ADN extraits de ces spécimens. Le sous-typage moléculaire était basé sur la caractérisation génétique des gènes répétitifs tréponémiques, arp et tpr. La détection de la résistance des macrolides a été réalisée par identification de la mutation du ribosome Modèle d’esquisse Résultats Trente-huit patients atteints de syphilis primaire présentaient un ADN de Treponema pallidum dans leurs lésions génitales par des tests PCR utilisant des amorces ciblant les gènes bmp, tpp et polA Aucun des patients sans syphilis n’avait de résultats PCR positifs Cinq sous-types moléculaires ont été identifié, avec le type f causant% des cas Tous les patients étaient infectés par des souches résistantes aux macrolidesConclusions Trois cibles géniques tréponémiques communes bmp, tpp- et polA étaient détectables par PCR chez les patients atteints de syphilis primaire Un seul clone caractérisé comme f et montrant une résistance aux macrolides semble avoir causé la plupart des cas de syphilis primaire dans cette étude

Parce que Treponema pallidum, la bactérie qui cause la syphilis, ne peut pas être cultivé sur des milieux bactériologiques standard, le diagnostic de laboratoire est traditionnellement fait par l’une ou l’autre des méthodes de surveillance de la syphilis en Chine. Cependant, aucune de ces méthodes n’est sensible ou spécifique, et elles ne permettent pas de caractériser davantage les souches bactériennes impliquées. Par conséquent, les études moléculaires semblent être des méthodes complémentaires logiques pour la détection de l’organisme dans des échantillons cliniques. l’étude de laboratoire de l’infection de la syphilis, car ils peuvent également fournir des informations de typage et de sensibilité aux antibiotiques de l’organisme Le traitement standard pour la syphilis est la benzathine pénicilline G, et malgré son utilisation pour & gt; En cas d’allergie à la pénicilline, des alternatives peuvent inclure la tétracycline ou la doxycycline, l’érythromycine ou l’azithromycine et la ceftriaxone Parmi ces alternatives, l’azithromycine présente l’avantage d’être administrée sous la forme d’une dose orale unique. , qui permet aux patients d’administrer la thérapie à leurs partenaires sexuels, une pratique recommandée dans le contrôle de la gonorrhée et de la chlamydia Cependant, des échecs thérapeutiques à l’azithromycine ont été signalés et des marqueurs de résistance in vitro [, La résistance à l’azithromycine est particulièrement répandue chez les hommes qui ont des rapports sexuels avec des hommes. L’opinion actuelle sur l’utilisation de l’azithromycine pour le traitement de la syphilis peut être limitée aux régions où la résistance à l’azithromycine est rare et soigneuse, clinique et sérologique. le suivi des patients est faisable Par conséquent, la surveillance de la résistance à l’azithromycine dans la syphilis est importantPillay et al ont développé un schéma de sous-typage moléculaire de T pallidum basé sur la caractérisation de gènes répétés, arp et tpr. Cependant, pour caractériser ces gènes, ils doivent être amplifiés directement à partir d’échantillons cliniques ou par propagation dans des testicules de lapin. selon le nombre de répétitions en tandem de paires de bases présentes dans leur gène arp Jusqu’à présent, aussi peu que les répétitions et aussi élevées que les répétitions ont été décrites. L’analyse du polymorphisme de longueur de fragment de restriction du gène tpr permet de grouper les souches et nommé avec des lettres en fonction d’une combinaison de tailles de fragments En combinant ces schémas, les souches peuvent être typées en fonction des caractéristiques de ces gènes; par exemple, la souche de référence Nichols a été typée comme Cette étude a été réalisée à la Shanghai Skin Disease et STD Hospital SSSH; Shanghai, en Chine, au début et à la fin de Shanghai, avec une population de millions de personnes , a l’une des plus forte incidence d’infection syphilitique au pays:, de nouveaux cas ont été identifiés seuls. On estime que la SSSH identifie% -% La PCR n’est pas une méthode de laboratoire fréquemment utilisée pour l’investigation de la syphilis en Chine Nous rapportons donc notre expérience de l’utilisation de la PCR pour détecter l’infection primaire par la syphilis dans la ville. Les patients participant à la clinique d’IST de l’infection sexuellement transmissible au SSSH à Shanghai, Chine Des cas positifs à la PCR ont été étudiés pour caractériser les sous-types moléculaires des souches impliquées, ainsi que leur sensibilité aux antibiotiques macrolides

Matériaux et méthodes

Echantillons cliniques Pendant la période de décembre à mai, les patients présentant des symptômes compatibles avec les ulcères génitaux primaires de la syphilis à la clinique IST ont été inclus dans cette étude pour évaluation diagnostique moléculaire. Le diagnostic de syphilis a été confirmé par microscopie en champ sombre et / ou tests sérologiques. Des échantillons sérologiques ont également été prélevés sur les lésions génitales des patients du SSSH qui ne présentaient pas de syphilis, comme l’atteste la Résultats de la microscopie de terrain et résultats négatifs du test sérologique de syphilisAnalyse sérologique de la microscopie à fond clair et de la syphilis Les exsudats des ulcères génitaux ont été recueillis sur une lame microscopique propre en touchant directement la lame au fluide et examinés immédiatement par microscopie à fond noir par un personnel formé et expérimenté. Les exsudats séreux étaient Ils ont également été recueillis par écouvillonnage et remis en suspension dans de petits volumes de solution saline et stockés à-° C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour les tests moléculaires. Les échantillons de sérum ont été testés avec le test de sérum non chauffé rouge toluidine TRUST; Bio-technologie Rongsheng et test d’agglutination des particules Treponema pallidum TP-PA Fujirebio, conformément aux instructions du fabricantExtraction de l’ADN et méthodes PCR L’extraction de l’ADN des échantillons cliniques a été réalisée en utilisant le mini kit Qiagen QIAamp Eastwin Scientific conformément au protocole du fabricant. a été réalisée dans une salle blanche séparée de tout autre travail d’ADN pour minimiser la contamination potentielle des spécimens avec de l’ADN T pallidum exogène Le test de diagnostic PCR était basé sur la détection des gènes cibles tpp, bmp et polA en utilisant les protocoles décrits dans la littérature. Afin de déterminer la qualité des écouvillons prélevés sur les ulcères génitaux et la détection de substances potentielles inhibitrices de la PCR, une amplification du gène de la β-globline a été réalisée sur tous les échantillons négatifs à la PCR en utilisant des amorces et des conditions de PCR décrites par Keller et al. Détection de la résistance aux macrolides amplification par PCR du gène de l’ARN ribosomique de l’ARN ribosomique S et Le génotype de résistance aux macrolides a été confirmé par séquençage d’ADN des produits de PCR après purification avec un kit de purification QIAquick PCR Qiagen Les séquences d’ADN des deux brins obtenues par l’analyseur d’ADN ont été confirmées par MboII. xl Applied Biosystems a été édité, assemblé et aligné avec des séquences publiées obtenues à partir de souches résistantes et résistantes à l’azithromycine en utilisant un logiciel de DNAStar, version Sous-typage moléculaire Le sous-typage moléculaire a été effectué en caractérisant les gènes répétitifs tréponémiques, arp et tpr. répétitions en tandem de paires de bases dans le gène arp, PCR a été utilisée pour amplifier un fragment interne du gène arp englobant les répétitions, suivi du séquençage de l’ADN Caractérisation du gène tpr par analyse de polymorphisme de longueur de fragment de restriction Les deux protocoles ont été réalisés comme décrit dans la littérature, avec le exception de l’utilisation de Invitrogen Platinum PCR Supermix Haute Fidélité Taq Invitrogen Canada

Résultats

Les patients atteints de syphilis primaire étaient des hommes et des femmes, avec un âge médian de plusieurs années, – ans Quatorze patients% étaient des personnes âgées,% étaient des personnes âgées,% étaient des personnes âgées, et les% restants étaient âgés – Descripteur EUROVOC des patients, séropositif pour le VIH, séropositif pour le VIH, inconnu pour le VIH. La microscopie en fond noir a confirmé le diagnostic de syphilis primaire chez les patients et chez les patients restants, le diagnostic clinique a été confirmé par des résultats sérologiques positifs pour la syphilis. pour les patients, leurs résultats de laboratoire de la syphilis, et leurs statuts VIH sont résumés dans le tableau

Tableau View largeTélécharger les informations sur le patient, le type de spécimen et la syphilis Statut du test sérologique pour les patientsTable View largeTélécharger les informations sur le patient, le type de spécimen et la syphilis État du test sérologique pour les patients L’ADN pallidum a été détecté par PCR dans les prélèvements génitaux Le test PCR n’a pas permis de détecter l’ADN de T pallidum, malgré un résultat positif en microscopie à fond noir. Comme le gène de la β-globine n’a pas été détecté par PCR à partir de l’écouvillon dans ce cas, il semble que ce soit un échantillon inadéquat. l’absence de cellules hôtes dans le spécimen, ou il y avait des substances inhibitrices de la PCR sur la figure de l’échantillon montre les positions relatives des différents gènes cibles de la sous-espèce pallidum T génome pallidum

DiapositiveTaille large Télécharger la microscopie à champ large, le test sérologique et la réaction en chaîne de la polymérase Résultats pour les patients atteints de syphilis primaire et les patients sans SyphilisTable View largeDownload slideMicroscopie à champ proche, test sérologique et réaction en chaîne par polymérase Résultats PCR pour les patients atteints de syphilis primaire et patients sans syphilis Syphilis

Figure View largeTélécharger la carte du gène linéaire de Treponema pallidum sous-espèce pallidum basée sur la souche SS; Numéro d’accès GenBank NC_ montrant les positions relatives des gènes polA, tpp-, bmp, arp et tprFigure View largeTélécharger une carte génétique génique de Treponema pallidum sous-espèce pallidum basée sur la souche SS; Numéro d’accès GenBank NC_ montrant les positions relatives des gènes polA, tpp-, bmp, arp et tpr Chez les patients ayant un résultat positif au test PCR syphilis, toutes les cibles géniques tréponémiques bmp, tpp et polA ont été détectées. obtenus à partir des échantillons sur écouvillon mais non à partir de spécimens sanguins, que des échantillons de plaquettes ou de sang total aient été testés. Dans les cas positifs à la PCR, des souches avec des gènes arp contenant des unités répétées en tandem étaient dues à une souche avec arp Dans le cas de l’analyse du gène arp, les souches tréponémiques impliquées dans ces cas ont pu être classées en types: les cas ont été identifiés comme type f, les cas type d, et cas comme type e La combinaison des résultats de ces gènes a donné les types moléculaires suivants: les cas% étaient dus au type moléculaire f, les cas% étaient dus au type moléculaire d, et le cas% e Les données sur les séquences nucléotidiques des répétitions en tandem de la paire -base ont fourni de plus amples informations sur la constitution des gènes arp. base de souches qui fournissaient des données de séquences complètes pour leurs gènes arp, les souches présentaient tous les types de séquences identifiés précédemment dans les gènes arp de T pallidum sous-espèce pallidum -nomely, types,,, et / On croyait que le type / une combinaison de types et résultant d’un événement de recombinaison génétique Les types de séquence arp complets, ainsi que leurs types de restriction tpr, des cas positifs à la PCR sont décrits dans le tableau.

Vue de la table largeTéléchargement slideTpr Types et composition de la région répétée observée dans le gène arp chez Treponema pallidum StrainsTable View largeDownload slideTpr Types et composition de la région répétée observée dans le gène arp chez Treponema pallidum StrainsRestriction analyse de polymorphisme de longueur de fragment de l’ARNr de T pallidum segment de gène contenant le site actif macrolide a montré que, dans tous les cas, les organismes T pallidum étaient résistants à l’antibiotique macrolide séquençage de l’ADN des amplicons PCR confirmé la substitution acide nucléique AG qui confère la résistance aux macrolidesLes patients sans syphilis, définis sur la base de la syphilis négative test sérologique Les résultats TRUST et TP-PA et les résultats négatifs de l’examen des spécimens d’ulcères génitaux ont également eu des résultats PCR négatifs Tous les échantillons d’ulcères génitaux provenant des patients sans syphilis ont donné des résultats positifs aux tests PCR ciblant le gène de la β-globine, suggérant que le résultat négatif de la syphilis PCR s n’étaient pas dues à un échantillon inadéquat ou à la présence de substances inhibitrices dans les échantillons

Discussion

syphilis à Shanghai, Chine Le type moléculaire le plus commun, qui a causé% de tous les cas qui ont pu être entièrement typés, était également le type moléculaire le plus commun trouvé aux Etats-Unis causant un peu plus de% des cas examinés dans différentes études effectuées dans différents états à la fin s et au début s Le deuxième type le plus commun de T pallidum trouvé à Shanghai, en Chine d était le type le plus commun trouvé au Portugal causant% de leurs cas pendant – Il était aussi l’un des les types les plus communs à causer la syphilis primaire en Afrique du Sud et en Arizona , causant% et% des cas examinés dans ces localités, respectivement les types moléculaires e et d, qui ont été associés à des cas uniques, ont également été signalés dans États-Unis, où il a également été constaté que de rares cas isolés ont été signalés pour chaque sous-type L’identification du type moléculaire dans la majorité des cas de syphilis primaire à Shanghai a suggéré la transmission d’une souche commune. Il est impossible d’effectuer un suivi rétrospectif des contacts pour vérifier cette transmission communeEn incluant les données de séquence nucléotidique du gène arp, le nombre de types moléculaires identifiés à Shanghai, en Chine, a augmenté, suggérant qu’un sous-typage plus poussé est possible et pourrait s’avérer utile analyse des types moléculaires de T pallidum Nos données de séquences génétiques arp ont également confirmé que la plupart des souches de T pallidum, indépendamment du nombre de leurs répétitions en tandem, sont constituées de toutes les séquences protéiques identifiées précédemment dans l’étude de Harper et al. La séquence protéique trouvée dans les répétitions en tandem du gène arp parmi les souches de Shanghai [%] des spécimens examinés était aussi le type de séquence protéique le plus commun identifié dans l’étude par Harper et al Il semble que les souches T pallidum complément de tous les types de séquences de protéines dans leurs gènes arp ont été associés à des souches plus anciennes Par exemple, de telles souches identifiées dans t L’étude de Harper et al a été isolée avant, par exemple, la souche Nichols identifiée à, Hatti B in, Chicago B in, Dallas-in, et Baltimore- in Tous les isolats récents, comme ceux identifiés dans cette étude, ont tous Ces observations viennent étayer les données présentées par Harper et al et Liu et al selon lesquelles ce gène est soumis à une forte sélection immunitaire, et donc la diversification de sa séquence protéique est à prévoir avec Si c’est le cas, il est intéressant de noter qu’une souche f de cette étude possédait une protéine répétitive acide unique, avec des unités répétées, différente du type le plus commun identifié dans cette étude ainsi que dans l’étude de Harper. et al La prévalence d’une telle souche présentant cette séquence unique d’acides aminés ARP, ainsi que la possibilité de trouver des souches avec d’autres séquences d’acides aminés à Shanghai et dans d’autres parties de la Chine, devraient être étudiées diversité des types moléculaires de souches de syphilis en Chine et pour mieux comprendre l’évolution du gène arp pendant les périodes de syphilis épidémique ou endémique En outre, le nombre de répétitions et les types de séquences d’acides aminés de la protéine ARP seront utiles pour l’éclosion En ce qui concerne la résistance aux macrolides chez T pallidum, cette étude pourrait également être la première à fournir des preuves moléculaires de telles souches en Chine. Tous les cas de notre étude étaient dus à des souches avec le génotype montrant une substitution acide aminé de la guinanine pour l’adénine. AG, le type de mutation le plus commun associé à la résistance aux macrolides Dans cette étude, nous avons fourni des données montrant que les souches de résistance aux macrolides isolées de la syphilis primaire sont très répandues à Shanghai, en Chine. peut être liée aux antibiotiques disponibles en vente libre, y compris les marcrolides, que de nombreux Nos conclusions actuelles devraient convaincre les cliniciens en Chine de ne pas se fier à l’azithromycine pour le traitement ou la prophylaxie de la syphilis. Les limites de cette étude incluent le fait que des échantillons ont été prélevés dans une seule clinique en quelques mois et le manque de données épidémiologiques. Par conséquent, nos données sur la prévalence de la résistance à l’azithromycine et l’identité des types moléculaires détectés à Shanghai doivent être interprétées avec prudence. En résumé, la PCR a été appliquée à la confirmation en laboratoire de la syphilis primaire, avec détection d’un T pallidum dans l’ulcère génito-urinaire La confirmation de laboratoire de la forte prévalence de souches de T pallidum montrant une résistance aux macrolides à Shanghai a été réalisée par analyse génétique de la cible du gène S rRNA Cinq types moléculaires différents, incluant une séquence ARP non décrite, ont été identifiés parmi les cas de syphilis primaire fournir un génotypage complet informati sur

Remerciements

Nous aimerions remercier le personnel du Laboratoire national de microbiologie pour son travail de séquençage de l’ADN. Le Fonds de science de la nature de Shanghai ZB à WG et YY et le Bureau du scientifique en chef de Santé Canada pour la recherche sur la syphilis aux conflits d’intérêts potentiels. pas de conflits