Standardisation des tests de Chlamydia pneumoniae: Recommandations des Centers for Disease Control and Prevention des États-Unis et du Laboratoire de lutte contre la maladie Canada

Chlamydia pneumoniae a été associée à l’athérosclérose et plusieurs autres maladies chroniques, mais les rapports de différents laboratoires sont très variables et les «normes d’or» manquent, ce qui a conduit à des appels à des approches plus standardisées pour les tests diagnostiques. les approches disponibles pour les tests sérologiques, la culture, l’amplification de l’ADN et les diagnostics tissulaires afin de formuler des recommandations spécifiques. En ce qui concerne les tests sérologiques, seule l’utilisation de la microimmunofluorescence est recommandée, des définitions standardisées de «infection aiguë» et «exposition antérieure» sont proposées. La confirmation d’un résultat de culture positif nécessite la propagation de l’isolat ou la confirmation par l’utilisation de la réaction en chaîne par polymérase PCR Quatre des tests de PCR décrits dans les rapports publiés ont rencontré la validation proposée critères Mor L’utilisation cohérente d’anticorps et de tissus de contrôle et l’amélioration de la compétence pour identifier les artefacts de coloration sont nécessaires pour éviter les résultats faussement positifs de la coloration immunohistochimique. Ces normes devraient être appliquées dans les enquêtes futures et périodiquement modifiées comme indiqué.

Chlamydia pneumoniae est une bactérie fastidieuse qui a d’abord été établie comme une cause d’infection respiratoire aiguë & gt; il y a des années; Plus récemment, il a été associé à certaines maladies chroniques, y compris la maladie cardiovasculaire athéroscléreuse. Le spectre sans cesse croissant de maladies associées à l’infection par C pneumoniae a entraîné un afflux important de nouveaux chercheurs et de nouveaux laboratoires impliqués dans la recherche sur Chlamydia. contradictoire et difficile à interpréter; Par conséquent, les chercheurs sur le terrain et les évaluateurs externes ont demandé des techniques de diagnostic validées et standardisées pour promouvoir les applications de recherche et améliorer la reconnaissance et les soins des patients infectés par C. pneumoniae Récemment convoqué par le Centre de contrôle et de prévention des maladies d’Atlanta et le Laboratoire de lutte contre la maladie Ottawa (Ontario) Canada pour examiner les tests de diagnostic actuels pour C pneumoniae et formuler des recommandations pour des approches normalisées

Tests sérologiques

Il n’existe pas de méthodes sérologiques totalement satisfaisantes pour le diagnostic de l’infection par C. pneumoniae Les problèmes proviennent de la difficulté d’obtenir des échantillons sériques appariés, de la prévalence élevée des anticorps IgG dans certaines populations adultes, du manque de méthodes d’essai standardisées et d’une pénurie de Réactifs de qualitéPour les patients atteints d’une infection aiguë au C pneumoniae, il est important de prendre en compte la cinétique de la réponse anticorps. Chez les patients infectés, l’anticorps IgM apparaît ~ semaines après le début de la maladie et est généralement indétectable après atteindre un titre élevé jusqu’à – semaines après le début de la maladie L’infection à C pneumoniae n’induit pas une bonne immunité protectrice et une réinfection peut survenir En cas de réinfection, les anticorps IgM peuvent ne pas apparaître et le taux d’anticorps IgG augmente rapidement. le plus souvent ne fournit qu’un diagnostic rétrospectif de l’infection aiguë, beca utiliser un échantillon de sérum convalescent est nécessaire pour montrer une augmentation du titre, donc ce n’est pas optimal pour la prise en charge du patient. Néanmoins, les tests sérologiques sont les moyens les plus utiles pour déterminer la cause d’une épidémie ou la prévalence d’infection dans les études épidémiologiques.

Examen des tests actuellement utilisés: tests sérologiques

La fixation du complément CF, fluorescence d’inclusion totale et EIA ne peut actuellement être endossée La FC a des objectifs objectifs et peut détecter des augmentations des niveaux d’anticorps dans les échantillons obtenus à des intervalles proches de la semaine, mais le test réagit avec d’autres espèces de Chlamydia et d’autres bactéries, la sensibilité pour détecter la réinfection est faible, et les réactifs ne sont pas facilement disponibles Les tests de fluorescence à inclusion totale sont disponibles en kits commerciaux, mais ils ne sont pas spécifiques à l’espèce et n’ont pas été largement évalués. Le plus prometteur, et plusieurs kits sont disponibles dans le commerce, bien qu’aucun n’ait été approuvé par la Food and Drug Administration aux États-Unis. Les avantages de l’EIA comprennent un haut débit, des objectifs objectifs, l’accessibilité technique et un enregistrement électronique des données. résultats Cependant, les évaluations publiées limitées de ces kits qui ont paru à ce jour ont inclus des rapports de problèmes avec les deux sensibilité Par conséquent, aucun essai actuellement disponible ne peut être recommandé en raison d’un manque d’évaluations évaluées par les pairs pour documenter que la spécificité est adéquate par rapport à celle de la micro-immunofluorescence MIF En outre, l’utilisation de l’EIA comme méthode de dépistage n’est pas approuvée. La sensibilité élevée requise par cette approche n’a pas été démontrée. Le test MIF est la méthode de test sérologique de choix pour le diagnostic de l’infection aiguë au C. pneumoniae C’est l’utilisation du MIF qui a permis d’identifier C pneumoniae comme une espèce distincte de Chlamydia C’est le seul test d’anticorps spécifique à l’espèce qui peut mesurer les titres d’anticorps spécifiques à chaque espèce de Chlamydia. La spécificité du test MIF peut être attribuée à l’utilisation de corps élémentaires purifiés de toutes les espèces de Chlamydia plutôt que de corps réticulés exprimant épitopes prédominants propres au genre Le format du test utilise des corps élémentaires formalisés et purifiés oniae, Chlamydia trachomatis et Chlamydia psittaci qui ont été fixés sur des lames de verre en tant que points distincts d’antigène. Des dilutions de sérums sont placées sur les points antigéniques et incubées. Cependant, le test est techniquement complexe, l’interprétation subjective et les réactifs a été standardisé Les kits basés sur le format MIF sont disponibles dans le commerce Leurs caractéristiques de performance nécessitent une évaluation plus approfondie et une publication évaluée par les pairs avant approbation

Recommandations spécifiques pour les tests sérologiques

Une approche standardisée pour l’exécution et l’interprétation du test MIF est présentée dans le tableau Les procédures d’assurance qualité sont particulièrement importantes à souligner en raison de la nature subjective de l’interprétation; ils sont inclus dans le tableau

Recommandations de l’utilisation du test de micro-immunofluorescencePlusieurs mises en garde concernant les tests sérologiques MIF sont importantes à mettre en évidence Le diagnostic d’infection aiguë basé sur un seul titre d’IgG ne peut pas être systématiquement recommandé; Si des titres d’IgG uniques sont signalés, ils doivent être interprétés avec prudence. Les échantillons sériques obtenus chez des patients âgés et chez des patients atteints de bronchopneumopathie chronique obstructive ont des titres d’IgG persistants élevés en l’absence de maladie cliniquement apparente. Résultats des IgM faussement positifs dus à la présence de facteur rhumatoïde dans les sérums La qualité des conjugués IgA varie et leur utilisation nécessite une évaluation soigneuse et une standardisation ultérieure Enfin, l’absence d’anticorps MIF chez les personnes ayant une infection confirmée par culture a été rapporté Ceci est rare chez les adultes mais peut être plus fréquent chez les jeunes enfants L’un des aspects les plus difficiles du test C pneumoniae est l’identification des personnes présentant une infection persistante ou chronique au moyen de tests sérologiques. des anticorps IgA ont été fréquemment utilisés Il n’y a pas de test de référence pour valider les l’infection, et les études qui ont tenté de corréler les niveaux d’anticorps IgG ou IgA à un seul échantillon avec l’état de la maladie ont donné des résultats équivoques, en partie à cause des différentes méthodologies et seuils de titrage utilisés dans différentes études les titres élevés d’IgA peuvent être un meilleur marqueur de l’infection chronique par C pneumoniae que les titres d’IgG parce que l’IgA sérique a une demi-vie de – jours, alors que l’IgG a une demi-vie de plusieurs semaines à plusieurs mois. d’infection persistante ou chronique, et l’utilisation de tests sérologiques pour définir les patients comme «infectés de façon persistante» doit attendre une validation plus poussée

Culture

C pneumoniae est une bactérie intracellulaire obligatoire et doit être cultivée dans une cellule hôte eucaryote La spécificité de la culture dépend de la capacité du laboratoire à distinguer les véritables inclusions de Chlamydia des artefacts lors de l’examen microscopique de la monocouche cellulaire après coloration de l’anticorps fluorescent. Les tests non basés sur la culture, tels que la PCR, sont largement utilisés pour détecter l’infection à Chlamydia, en partie à cause de la complexité technique et du faible rendement des protocoles de culture. Les problèmes de faible production peuvent aussi être liés à la contamination par Mycoplasma espèce Cependant, la culture reste essentielle pour documenter la viabilité de l’organisme, fournir des isolats de l’organisme pour la caractérisation biologique et les tests de sensibilité aux antimicrobiens, et pour évaluer l’efficacité microbiologique dans les essais de traitement

Examen des protocoles actuellement publiés pour la culture

Toutes les procédures de culture actuellement acceptées impliquent l’inoculation d’un échantillon sur une lignée cellulaire humaine par centrifugation. Les cellules inoculées sont incubées et sont ensuite colorées avec un anticorps marqué fluorescent spécifique à Chlamydia pour visualiser les bactéries qui se multiplient dans les cellules hôtes. modifications de ces procédures qui restent controversées Elles comprennent la centrifugation simultanée de la lignée cellulaire et de l’inoculum sur le récipient de culture , l’utilisation de milieu de culture cellulaire sans sérum , la prolongation des temps de culture et l’augmentation du nombre de les cultures sont centrifugées après inoculation Des monocouches de cellules hôtes ont été prétraitées avec du polyéthylène glycol, de la trypsine et du diéthylaminoéthyl dextrane pour améliorer la récupération des isolats de C pneumoniae à partir de spécimens vrais ou faux D’autres chercheurs ont cependant signalé que prétraitement de diéthylaminoéthyl dextran a effectivement diminué la taille des inclusions ou a échoué à docum ent amélioration de la récupération par l’utilisation de l’une ou l’autre technique Aucune de ces modifications n’a été suffisamment testée pour justifier leur recommandation de routine. Le nombre de passages d’une culture avant la détermination des résultats suscite de nombreuses controverses ⩾ des passages après l’étape de culture primaire sont nécessaires pour maximiser la récupération des isolats de C pneumoniae à partir d’échantillons respiratoires D’autres rapports ont utilisé avec succès un plus grand nombre de passages, en particulier pour isoler des spécimens de tissus. Une augmentation des passages peut entraîner une concentration de débris cellulaires pouvant contribuer à une coloration non spécifique de la monocouche. Nous recommandons de cultiver les échantillons respiratoires par des procédures d’isolement primaire et des passages supplémentaires. Les échantillons tissulaires doivent être cultivés par des procédures d’isolement primaire.

Recommandations spécifiques pour la culture

Types de spécimens Les spécimens obtenus pour la détection d’infection pulmonaire C pneumoniae par culture comprennent des écouvillons du nasopharynx ou de l’oropharynx, des échantillons d’expectorations, des échantillons de lavage bronchoalvéolaire et des spécimens de biopsie tissulaire. C pneumoniae n’a pas été cultivé avec succès à partir d’échantillons sanguins. Les prélèvements doivent être prélevés uniquement sur des écouvillons avec un embout en Dacron et une tige en aluminium ou en plastique. Écouvillons avec de l’alginate de calcium ou des pointes de coton et les arbres en bois peuvent inhiber la croissance de l’organisme, en fonction de l’adhésif utilisé, et sont inacceptables. Les écouvillons doivent être placés dans du milieu de transport SP saccharose, g; phosphate de potassium dibasique, g; phosphate de potassium monobasique, g; gentamicine, μg / mL; amphotéricine B, pg / ml; vancomycine, μg / mL; et% -% sérum de veau fœtal, complété jusqu’à un volume final de mL, pH et non éliminé avant le transport Les échantillons de lavage broncho-alvéolaire, d’expectoration et de liquide pleural doivent être prélevés dans SP à un rapport de spécimen à moyen: Transport des échantillons Tous les échantillons Les échantillons qui ne peuvent pas être transformés en h doivent être congelés et conservés à – ° CSpecimen processing Les écouvillons doivent être vortexés dans le milieu de transport pendant – s et pressés. Le spécimen est ensuite centrifugé à -, g, remis en suspension dans un milieu de culture cellulaire et homogénéisé. Il convient de noter que les expectorations inhibent fréquemment les expectorations. croissance cellulaire et peut être toxique pour la monocouche Les zones calcifiées des échantillons de tissu vasculaire doivent être retirées et le tissu remis en suspension dans un milieu de culture cellulaire avant l’homogénéisation. Procédures d’analyse et contrôle de la qualité L’utilisation de méthanol comme fixateur pour les monocouches avant coloration doit être évitée ou évaluée à l’avance, car il existe certaines preuves que l’antigénicité de certaines protéines peut être détruite .

Table View largeTélécharger la slideRecommandations pour l’utilisation de la culture pour Chlamydia pneumoniaeTable View largeTélécharger la lameRecommandations pour l’utilisation de la culture pour Chlamydia pneumoniaeQuelques inclusions qui ne se propagent pas dans les passages suivants doivent être considérées comme un résultat tous les résultats de culture pour C pneumoniae, nous recommandons que la détection d’une moyenne de ⩾ inclusions par puits ou tube soit considérée comme un « présomptif positif » Seulement si la souche peut être propagée au moyen d’un passage ultérieur ou confirmée par un test supplémentaire tel que la PCR, doit-il être signalé comme « confirmé positif »? Il faut également reconnaître que C pneumoniae a été cultivé à partir de spécimens des voies respiratoires supérieures prélevés chez des personnes asymptomatiques.

PCR

La description du spectre clinique de la maladie de C pneumoniae a été entravée par l’absence de méthodes diagnostiques suffisamment sensibles. Les techniques d’amplification à base d’acide nucléique, telles que la PCR, ont identifié C pneumoniae dans des échantillons cliniques allant des échantillons respiratoires aux échantillons de vaisseaux sanguins. tissu , sérum et cellules mononucléées du sang périphérique Malgré des améliorations significatives dans le développement de méthodes moléculaires pour la détection de C pneumoniae, certains laboratoires rapportent une détection cohérente de l’organisme dans des échantillons de tissu vasculaire [,,,] Cette variation peut être liée aux différences dans les moyens de collecte et de traitement des échantillons, à la conception des amorces, à l’extraction des acides nucléiques, à la détection des produits d’amplification ou à la prévention des faux positifs et faux négatifs

Examen des tests actuels: PCR

Le tableau résume les rapports sur les tests PCR, publiés en mai, avec les régions cibles, les tailles de produits et les méthodes de détection des produits. Bien que de nombreuses méthodes PCR internes soient disponibles pour la détection de C pneumoniae, la sensibilité et la spécificité de ces tests restent inconnus. Des études supplémentaires doivent être menées en utilisant des contrôles appropriés et un grand nombre d’échantillons cliniques prélevés sur les patients pour comparer et évaluer plus adéquatement l’utilité de différents tests de PCR pour le diagnostic d’infection à C. pneumoniae. ceux d’un système de culture sensible et au moins un autre test PCR validé qui cible un gène différent ou une séquence différente du même gène est nécessaire pour valider tout nouvel essai de PCR proposé

Tableau View largeTélécharger slidePCR tests pour la détection de Chlamydia pneumoniae dans des échantillons cliniquesTable View largeTélécharger la lameTest de PCR pour la détection de Chlamydia pneumoniae dans des échantillons cliniquesDans les tests décrits dans le tableau, seuls les protocoles largement utilisés, mis en évidence en haut du tableau, satisfont aux critères optimaux Pour un test validé Tout d’abord, ils ont été validés pour la sensibilité et la spécificité dans des laboratoires extérieurs utilisant à la fois des spécimens artificiels calibrés et de vrais échantillons cliniques. Deuxièmement, la sensibilité a été documentée à un niveau de détection de & lt; Enfin, pour chacun de ces tests, la spécificité a été documentée contre d’autres espèces de Chlamydia ainsi qu’une large gamme d’autres ADN procaryotes et eucaryotes. Nous soulignons que tous ces tests sont des outils de recherche et aucun n’a été standardisé ou commercialisé. cleared by the FDAEach Le type de PCR a des avantages et des inconvénients qui doivent être soigneusement pris en compte avant la conception ou l’évaluation de nouveaux tests. Sept approches PCR et les avantages et les inconvénients de chaque approche sont brièvement examinéesNested PCR est, en général, plus sensible que la PCR en une seule étape. en raison de l’amplification -step et de l’utilisation d’ensembles d’amorces Les inconvénients de la PCR nichée sont le risque accru de contamination et de réamplification des produits, ce qui rend le test plus long et plus coûteux qu’une amplification PCR multiplexe & gt; séquence cible dans le même essai Pour le genre Chlamydia, ceci a été utilisé pour discriminer entre espèces. Les réactions multiplex diminuent la sensibilité et la spécificité si les températures d’hybridation pour les différentes amorces ne sont pas identiques En général, ces tests ne sont pas aussi sensibles poux. Ces contrôles peuvent avoir l’inconvénient de concurrencer les amorces lorsque des amorces identiques sont utilisées à la fois pour les gènes cibles et les contrôles internes. Si un ensemble différent d’amorces est utilisé Pour détecter le contrôle interne, les différences dans les conditions d’amplification peuvent diminuer la sensibilité. Les PCR à démarrage rapide augmentent la spécificité en empêchant la liaison non spécifique à des températures inférieures à la température optimale. Ces essais ne sont pas recommandés. d’autres, la nécessité d’ouvrir le tube pour ajouter plus de polymérase dans augmente les risques de contamination Les PCR d’atténuation augmentent la spécificité en permettant aux événements initiaux d’hybridation amorces-matrice de survenir à des températures d’hybridation supérieures à la température optimale d’hybridation. Cependant, ce type de PCR nécessite plus de cycles, ce qui augmente la durée du PCR. Ils peuvent également augmenter la sensibilité, par rapport à la visualisation standard des produits de PCR dans le gel d’agarose après électrophorèse et coloration au bromure d’éthidium. Ces méthodes ont l’inconvénient d’augmenter le coût des réactifs et sont, en général, Plus de temps que les méthodes sans sonde Les tests à base de sondes fluorescentes actuellement développées présentent les avantages d’un système fermé qui évite la contamination par le report de produit PCR. Ils peuvent avoir des lectures en temps réel ou en point final, selon le système utilisé Ces tests peuvent être plus sensibles et sont inhérents y plus spécifique que la PCR en une seule étape en raison de la double fixation de l’amorce et de la sonde Cependant, l’équipement requis est très coûteux

Recommandations spécifiques pour la PCR

Collecte et traitement des échantillons Les recommandations spécifiques concernant la collecte, le transport et le traitement des échantillons cliniques sont similaires à celles décrites dans la section culture. Une partie aliquote du milieu de transport doit être centrifugée à ~, g pendant min. Les tubes de préparation des cellules disponibles dans le commerce facilitent la séparation des cellules mononucléaires du sang total. Les échantillons de tissus doivent être coupés en petits morceaux ~ mg et traités pour l’extraction de l’ADN. Les échantillons doivent être formés en aliquotes pour éviter & gt; Cycle de congélation-décongélation pour un rendement optimalLes échantillons, les contrôles et les réactifs du mélange PCR doivent être manipulés avec des pipettes dédiées dans des zones séparées physiquement afin d’éviter toute contamination. Les pointes de pipettes, les blouses de laboratoire et les gants sont fortement recommandés. contamination par des tests par frottis Procédures d’essai et contrôle qualité: extraction de l’ADN L’ADN de C pneumoniae doit être extrait des échantillons cliniques par un protocole hautement efficace et fiable. Toute nouvelle méthode d’extraction doit être validée avant utilisation systématique et doit être évaluée Polymérases Procédures d’analyse et de contrôle de qualité: contrôles positifs et négatifs Ils doivent être inclus dans toutes les analyses, en parallèle avec les échantillons cliniques tout au long des procédures d’extraction et de détection. Les contrôles positifs doivent consister en petites et très petites quantités de titrages d’ADN jusqu’à & lt; ng d’ADN d’une culture avec & lt; IFU Chaque laboratoire doit préparer des titrages de ses stocks de C pneumoniae et former un grand nombre de contrôles positifs faibles et très faibles en aliquots. Au moins un contrôle négatif, constitué d’eau à la place de l’échantillon clinique, doit être effectué tous les cinq contrôle: contrôles d’amplification L’utilisation d’ADN non apparent dopé ajoute de la validité aux résultats en identifiant des inhibiteurs potentiels dans les échantillons ou dans la réaction PCR elle-même. De tels contrôles doivent être inclus dans les tests nouvellement développés. ], MIMICS ou des amorces compétitives , et des fragments clonés dans le vecteur pUC En raison du potentiel de concurrence du contrôle avec la séquence cible, un faible nombre d’ADN de contrôle est important.Développement et contrôle de la qualité des nouveaux tests PCR est un besoin critique pour des essais normalisés commercialement, approuvés par la FDA En attendant, les chercheurs devraient concevoir des amorces et des pro Les séquences d’ADN ciblées doivent être recherchées à l’aide de l’outil Basic Local Alignment Sequence Tool disponible à l’adresse http: // wwwncbinlmnihgov / BLAST / pour vérifier la spécificité. Toutes les amorces ou sondes nouvellement développées doivent être recherchées. être validé pour la sensibilité et la spécificité analytiques. La sensibilité doit être déterminée en effectuant des titrages d’isolats désignés pour déterminer le plus bas niveau de détection du gène cible. Les souches de type C pneumoniae TW-ATCC VR- et CM-ATCC VR- doivent au moins être titrées Dans l’idéal, toutes les souches de C pneumoniae disponibles devraient être testées pour la contamination par des espèces de Mycoplasma en utilisant une PCR spécifique au genre et avec des cultures mères qui sont titrées de la même manière. la spécificité des nouvelles amorces et sondes devrait être testée avec une banque de préparations d’ADN de C psittaci, C trachomatis et ses bactéries et virus communément présents dans les voies respiratoires, avec l’ADN humain, et avec au moins les PCR recommandées dans le tableau par le laboratoire développant le test et par un laboratoire indépendantInterprétation et rapport des résultats Pour une plus grande spécificité, les échantillons positifs sont souvent Les tests de répétition sélective de spécimens positifs seulement introduisent un biais délibéré vers une diminution de la sensibilité tout en augmentant la spécificité. Chaque fois que cela est possible, les personnes qui effectuent les essais et interprètent les résultats des études de recherche doivent être aveugles au patient. résultats d’autres tests de statut d’anticorps, de culture ou de résultats diagnostiques tissulaires Les publications qui en résultent doivent préciser comment l’aveuglement a été assuré ou pourquoi cela n’a pas été fait

Immunohistochimie de diagnostic de tissu

C pneumoniae a été détecté dans des échantillons de tissus en utilisant une variété de méthodes De ces méthodes, immunofluorescence, immunohistochimie IHC et hybridation in situ offrent l’avantage de préserver la morphologie tissulaire et de permettre la localisation de l’agent infectieux dans des zones et cellules spécifiques Les types de cellules susceptibles d’être infectés comprennent les macrophages, l’endothélium et les muscles lisses Parmi les méthodes de diagnostic tissulaire, l’IHC a été le plus fréquemment utilisé dans les études de C pneumoniae, et nous nous concentrerons sur cette méthode. le défi critique, parce que les résultats vrai-positifs de la figure de coloration et les résultats faussement positifs de la coloration peuvent être très difficiles à distinguer

Figure View largeDownload slide Résultats positifs de la coloration des cellules musculaires lisses de Chlamydia pneumoniae dans une flèche d’athérome par l’utilisation de l’anticorps TT-, de la méthode ABC du complexe avidine-biotine et de la peroxydase de raifort Reproduit avec la permission de des cellules musculaires lisses de Chlamydia pneumoniae dans une flèche d’athérome par l’utilisation de l’anticorps TT, de la méthode ABC du complexe avidine-biotine et de la peroxydase de raifort Reproduit avec la permission de

Vue de la figure grandDownload slideA, fausse-positive Chlamydia coloration des cellules musculaires lisses dans une flèche athérome par l’utilisation de la méthode ABC avidine-biotine, peroxydase de raifort, et un anticorps monoclonal spécifique de Chlamydia CF-B, le même bloc de tissu montrant coloration similaire avec un anticorps monoclonal non spécifique du même anticorps IgGa de l’isotype C du virus de la fièvre Lassa, coloration de Chlamydia faussement positive de macrophages de cellules inflammatoires par utilisation de ABC, peroxydase de raifort, et anticorps monoclonal spécifique de Chlamydia CF-D, même bloc tissulaire coloration similaire avec un anticorps monoclonal non spécifique du même anticorps IgGa contre le virus de la fièvre de LassaFigure View largeTélécharger la diapositive A, fausse-positive Chlamydia coloration d’une cellule musculaire lisse dans une flèche d’athérome en utilisant la méthode ABC du complexe avidine-biotine, peroxydase de raifort et anticorps monoclonal spécifique de Chlamydia CF-B, Le même bloc de tissu montrant une coloration similaire avec un monoclona non spécifique l anticorps du même isotype IgGa anticorps contre le virus de la fièvre Lassa C, coloration faussement positive à la chlamydia des cellules inflammatoires macrophages par l’utilisation de ABC, peroxydase de raifort, et un anticorps monoclonal spécifique de Chlamydia CF-D, le même bloc tissulaire montrant une coloration similaire avec un anticorps monoclonal non spécifique du même anticorps IgGa d’isotype contre le virus de la fièvre de Lassa en mai, & gt; publications ont signalé la détection de C pneumoniae par l’utilisation de IHC dans les plaques athéromateuses obtenues à partir de divers sites chez les humains [,,, -] et animaux Les taux de détection dans les athéromes humains ont varié considérablement ,] Les études qui ont signalé la détection de C pneumoniae dans la même plaque athéromateuse par l’utilisation de l’IHC et d’autres méthodes, telles que la culture ou la PCR, ont montré une mauvaise corrélation entre les différentes méthodes [,,] Typiquement, les taux de détection sont déterminés par l’utilisation de l’IHC est plus élevée que celle déterminée par l’utilisation de la PCR Ceci est attribué à plusieurs facteurs, dont la dégradation plus rapide de l’ADN comparé aux antigènes, la difficulté d’extraction de l’ADN des athéromes due aux calcifications et la présence d’inhibiteurs de la PCR. Il est possible que ces divergences soient dues, en partie, à des résultats faussement positifs et faussement négatifs de l’IHC. Cependant, cela a été difficile à évaluer en l’absence d’un approche ardue pour la méthodologie et l’interprétation des résultats de l’IHC

Examen des tests et recommandations actuellement utilisés pour l’IHC

Procédure Le test IHC le plus largement utilisé est la méthode immuno-complexe avidine-biotinylée Cependant, il existe des variations interlaboratoires à différentes étapes de la méthode, y compris le prétraitement des tissus, l’amplification du signal tyramide et la détection colorimétrique. Les étapes procédurales susmentionnées n’ont pas été évaluées, nous ne pouvons pas encore recommander une approche standardisée Une étude IHC qui compare ces problèmes méthodologiques dans les tissus témoins est recommandéeAntibodies La majorité des études publiées ont utilisé CF-, un anticorps monoclonal dirigé contre le lipopolysaccharide de toutes les espèces de Chlamydia [,,,], ou RR- et TT-, anticorps spécifiques de C pneumoniae [,,] Il existe des preuves de différences de réactivité entre les différents anticorps L’utilisation de CF- est un compromis raisonnable pour le dépistage initial car aucune autre espèce de Chlamydia n’a été trouvée dans les athéromes, mais les patients positivement identifiés par l’utilisation de cet anticorps devraient Des anticorps de contrôle négatif doivent être utilisés pour chaque échantillon afin d’évaluer la coloration de fond du tissu. La plupart des études rapportées ont utilisé les anticorps dans le liquide ascitique de souris comme seul effet négatif. contrôle Cependant, le meilleur contrôle négatif des anticorps devrait être un anticorps du même isotype que l’anticorps Chlamydia utilisé dans le test. Par exemple, si CF-, qui est un anticorps IgGa, est utilisé, l’anticorps témoin négatif devrait être un anticorps IgGa. dirigé contre un agent infectieux différent qui ne présente pas de réaction croisée avec les espèces de Chlamydia Par conséquent, nous recommandons l’utilisation d’anticorps de contrôle négatif pour chaque bloc tissulaire. Le premier devrait être un liquide ascitique normal de souris ou un sérum hyperimmun. Chlamydia anticorps du même isotypeTissues et contrôles Des tissus frais et fixés au formol ont été utilisés pour les tests de Chlamydia IHC Un positif et un négatif ti Théoriquement, les échantillons humains infectés devraient être le meilleur contrôle positif des tissus Cependant, la coloration IHC pour C pneumoniae dans les athéromes humains a été décrite comme très focale et rare, et cela n’a pas été possible Pour identifier les blocs tissulaires qui donnent systématiquement un résultat positif Les autres tissus témoins positifs actuellement utilisés comprennent les cellules de culture tissulaire infectées et les tissus d’animaux infectés expérimentalement. Les contrôles tissulaires négatifs inclus dans chaque série doivent être des cellules non infectées du même type que celles infectées par Chlamydia. cellules ou doivent être des échantillons d’artère normale, de cerveau, de poumon ou d’autres tissus appropriés pour le tissu expérimental. En outre, au moins des sections du même bloc de paraffine que le cas étudié doivent être incubées avec des anticorps négatifs et incluses dans les Chaque cycle En résumé, chaque cycle de coloration doit inclure des valeurs positives et négatives. Sue contrôle incubé avec les anticorps positifs et négatifs qui sont utilisés sur le spécimen d’intérêtInterprétation des résultats Établir la différence entre le signal et l’arrière-plan est la question cruciale L’interprétation de IHC pour les maladies infectieuses tend à s’appuyer plus fortement sur les corrélations entre la les bactéries et le contexte histopathologique type de cellule associée au signal Une interprétation précise nécessite une formation spécialisée et, au minimum, la capacité d’identifier et de distinguer systématiquement les principales cellules inflammatoires, les cellules polymorphonucléaires, les mastocytes et les cellules plasmatiques et les pigments lipofuscine, hémosidérine La coloration intracytoplasmique des macrophages, des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses doit être considérée comme un résultat positif Un motif de coloration granulaire intracytoplasmique à l’endroit correct et en l’absence d’artefact, évalué au moyen de lames de contrôle, constitue une véritable Il existe un désaccord quant à savoir si une coloration homogène dans le contexte approprié peut être considérée comme un résultat vrai-positif ou si une telle coloration doit toujours être considérée comme un artefact. Les conclusions et recommandations clés de cette réunion sont résumées dans le tableau. De plus, les participants à la réunion ont insisté sur la nécessité de concentrer leurs efforts sur plusieurs priorités de recherche futures, qui devraient toutes bénéficier d’une approche normalisée pour l’utilisation des tests, l’interprétation et le contrôle de la qualité.

Table View largeTélécharger la lameRecommandations pour la standardisation des tests diagnostiques de Chlamydia pneumoniaeTable Voir grandDownloadableRecommandations pour la standardisation des tests de diagnostic de Chlamydia pneumoniae

Membres du groupe d’étude

Ont participé à la réunion sur la normalisation des tests de diagnostic de Chlamydia pneumoniae Atlanta, avril: Claudiu Bandea, Carolyn Black, Dr George M Carlone, Dr Scott Dowell, Dr Barry Fields, Dr Jeannette Guarner, Dr Trudy Messmer, Dr Siobhán O Connor, Dr John Papp, Mme Mindy J Perilla, Dr Anne Schuchat, Mme Valerie Stevens, Dr Deborah Talkington, Dr M Lucia Tondella, Dr Chris A Van Beneden, Dr Sherif Zaki, et Mme Elizabeth R Zell Centre national des maladies infectieuses, Centres pour le contrôle et la prévention des maladies, Atlanta; Dr Cynthia Cohen Immunohistochimie et cytométrie d’image, Pathologie anatomique, Emory University Hospital, Atlanta; Dr Lee Ann Campbell, Dr Cho Chou Kuo, Dr San Pin Wang, Département de pathobiologie, Dr J Thomas Grayston Département d’épidémiologie et Dr Lisa A Jackson Département d’épidémiologie, École de santé publique et de médecine communautaire, Université de Washington, Seattle; Dr Carolyn D Deal Centre pour l’évaluation et la recherche sur les produits biologiques, Division FDA des produits bactériens, Washington DC; Dr Charlotte Gaydos Division des maladies infectieuses, Hôpital Johns Hopkins, Baltimore; Dr Margaret Hammerschlag SUNY Centre des sciences de la santé à Brooklyn, New York; Mme Laura Schindler Laboratoire des maladies infectieuses, Université de Louisville, Kentucky; Dr Christopher E Taylor Institut national des allergies et des maladies infectieuses, Washington DC; Dr Jim Mahony Laboratoire régional de virologie et de chlamydiologie, Hôpital St Joseph’s, Université McMaster, Canada; Dr Rosanna W Peeling Laboratoire de lutte contre la maladie, Santé Canada, Ottawa, Canada; Dr Ignatius William Fong Division des maladies infectieuses, Université de Toronto, Canada; Dr Maija Leinonen Institut national de santé publique, Oulu et Dr Pekka Saikku Département de microbiologie médicale, Université d’Oulu, Oulu, Finlande; Dr Matthias Maass Institut de microbiologie médicale et d’hygiène, Université médicale de Lubeck, Allemagne; Dr Jacobus M Ossewaarde Laboratoire de recherche sur les maladies infectieuses Institut national de la santé publique et de l’environnement, Pays-Bas; Dr Kenneth Persson Département de microbiologie clinique, Hôpital général de Malmö, Malmö, Suède; Dr Jens Boman Département de virologie clinique, Hôpital universitaire d’Umea, Umea, Suède; et Dr Petra Apfalter Département de microbiologie clinique, Institut d’hygiène, Université de Vienne, Autriche