Thiophènes hautement sélectifs et puissants comme inhibiteurs de PI3K avec activité antitumorale orale

Thiophènes hautement sélectifs et puissants comme inhibiteurs de PI3K avec activité antitumorale orale

Phosphatidylinositol-3-kinases (PI3Ks) sont des lipides kinases, qui phosphorylent PIP2 (phosphatidylinositol diphosphate) en PIP3 (phosphatidylinositol triphosphate), qui recrute PDK et AKT à la membrane cellulaire. AKT est activé par phosphorylation de la PDK liée à la membrane menant à une myriade de processus en aval, y compris la modulation de protéines telles que mTOR (cible mammalienne de la rapamycine), GSK3, Forkhead, NF et eNOS. De cette manière, la voie PI3K / AKT régule de nombreux processus tels que le métabolisme, la prolifération cellulaire, la croissance, la survie, l’angiogenèse et l’apoptose.1 L’activation aberrante de PI3K a été liée à la fois à l’initiation et au maintien de la tumeur. Pendant la tumorigenèse, l’activation de la voie PI3K / AKT / mTOR peut se produire par divers mécanismes, y compris la perte de PTEN (la phosphatase qui régule la signalisation PI3K), la surexpression ou l’activation de certains récepteurs tyrosine kinases (eg EGFR, HER-2), interaction avec Ras activé, surexpression de la PI3K – α (PIKC3A), ou des mutations dans PIKC3A qui causent une activité PI3K kinase élevée.2,2b La signalisation dérégulée de la voie PI3K / AKT / mTOR a été impliquée dans le mauvais pronostic et les faibles taux de survie dans de nombreuses formes de cancers incluant les tumeurs lymphatiques, les glioblastomes, les mélanomes, De nombreuses études précliniques et cliniques indiquent maintenant que PI3K joue un rôle clé dans la biologie des cancers humains.2,2b Cependant, la plupart des inhibiteurs de cette voie de signalisation ont une activité inhibitrice. contre les kinases PI3K et mTOR. On sait que les complexes mTOR 1 et 2 régulent la prolifération cellulaire, l’apoptose, l’angiogenèse et le métabolisme par des mécanismes AKT-dépendants et indépendants de l’AKT.4 Les agents ciblant les PI3K avec une activité inhibitrice de la mTOR kinase supplémentaire peuvent entraîner une toxicité supplémentaire par perturbation de mTOR fonctionner dans les cellules normales. Pour trouver un inhibiteur pour inhiber cette voie de signalisation critique avec un meilleur index thérapeutique, nous avons essayé de développer un médicament ciblant sélectivement PI3Ks.Plusieurs chémotypes ont été identifiés avec la puissance de liaison PI3K décente dans notre test HTS. Pour dériver la toxicité idiosyncratique associée à nos précédents inhibiteurs doubles PI3K / mTOR, nous avons préféré une nouvelle série avec un cocristal pertinent montrant la liaison de la protéine et du ligand. Ces informations structurelles nous permettraient de concevoir des composés via SBDD pour accélérer le processus d’optimisation du lead. Composé 1, un thiophène tétrasubstitué avec PI3K &#x003b1 modéré; Ki, 230 nM (Schéma 1), a donc été choisi pour d’autres recherches à partir d’autres hits HTS en raison de sa nouvelle structure et de la structure de cocrystal du composé 1 PI3K disponible (Figure 1) .1) . Contrairement aux thiophènes réguliers qui sont sujets aux métabolites oxydatifs et réactifs, ce composé de plomb tétra-substitué bloque tous les sites oxydatifs potentiels sur le noyau de thiophène, un fait qui a été confirmé par la suite par nos études sur le métabolisme des médicaments. Pour que les composés aient une bonne activité cellulaire, une bonne perméabilité et une bonne absorption, notre priorité initiale était de remplacer le fragment acide carboxylique libre, qui est généralement associé à une perméabilité et une absorption médiocres.6Figure 1 Structures cristallines des composés 1 (couleur brune) et 3 (couleur violette, code PDB: 3ML9) dans PI3K &#x003b3 ;. L’azote de l’anneau de morpholine du composé 1 représente le liant de charnière kinase.Schéma 1Progression du Thiophène HTS initial Hit 1 à Lead 4 L’amide carboxylique 2 correspondant a été ainsi fabriqué, et le composé a montré une amélioration de plus de 10 fois sur le PI3K &#x003b1 ; liaison et moins de 1 uM de puissance cellulaire dans notre test de phosphorylation S473 AKT cellulaire. En outre, le composé 2 a également fourni une bonne sélectivité par rapport à la kinase mTOR (schéma 1). Encouragés par ce résultat, nous avons soigneusement évalué les structures de co-cristal du composé 1 et de nos deux puissants inhibiteurs PI3K / mTOR de la série des 4-méthylpyridopyrimidinone 5 − 5c Nous voulions exploiter la relation structure / activité (SAR ) les enseignements de notre série de deux inhibiteurs et les appliquer pour améliorer à la fois la puissance et la sélectivité de notre nouvelle série de thiophène. Le groupement acide carboxylique du composé 1 correspond au groupement méthoxy pyrimidine dans la série 4-méthylpyridopyrimidinone comme indiqué dans les structures de co-cristaux chevauchantes sur la figure 11.1. Pour plus de clarté, le composé 1 est coloré en brun et le composé 3 est coloré en violet.On notera en particulier qu’une molécule d’eau sert de pont entre l’azote pyridyle du composé 3 et le PI3K γ enzyme. Dans la structure cocristalline du composé 3 montré sur la figure 22 (structure sur la gauche), il y a une molécule d’eau qui se trouve entre les résidus conservés Asp841 et Tyr867 de PI3K &#x003b3, qui correspondent aux Asp810 et Tyr836. résidus de PI3K &#x003b1 ;, respectivement. Cette molécule d’eau forme des liaisons H avec à la fois l’azote pyridyle du composé 3 comme mentionné précédemment et les résidus Asp et Tyr dans les PI3K, formant ainsi un réseau de liaison H (figure 2,2, à gauche). Pour garder cela intact dans les enzymes PI3K, un inhibiteur puissant doit être conçu pour ne pas perturber ce réseau de liaison H complexe, ou l’inhibiteur finira par perdre de sa puissance en raison de la pénalité d’énergie payée.Cette observation avait des ramifications importantes sur nos conceptions composées. En gardant cette observation à l’esprit, différents bioisostères d’amides ont été modélisés et synthétisés pour tester notre hypothèse: parmi ces analogues, le composé 4 avec un groupe 1,2,4-triazole se démarque car il présente un excellent PI3K & Ki (1,7 nM) , bonne activité cellulaire (S473 IC50 = 73 nM, Schéma 1), et bonne sélectivité contre mTOR (mTOR Ki = 434 nM; 255 × sélectivité) .Figure 2 Gauche: composé 3 dans PI3K &#x003b3 (code PDB: 3ML9) Il y a une eau entre Asp 841 et Tyr 867 pour maintenir un réseau de liaison H, d l’azote sur le cycle pyridine est en contact avec cette molécule d’eau. À droite: Modèle de liaison proposé pour le composé .. cognitif. Il est regrettable que nous n’ayons pas pu obtenir d’autres structures cocristallines dans cette série de thiophènes pour prouver notre modèle. Cependant, nous croyons que l’excellent PI3K α la puissance du composé 4 est due au groupe 1,2,4-triazole remplaçant la molécule d’eau dans le site de liaison ATP, tandis que l’azote N1 dans le triazole fonctionne comme un accepteur de liaison H pour interagir avec Tyr836, et l’azote N2 agit comme un donneur de liaison H interagissant avec Asp810, maintenant et stabilisant le PI3K &#x003b1 crucial; structure de la protéine (Figure 2, structure à droite) Le 1,2,4-triazole peut exister sous trois formes tautomères différentes comme indiqué dans le schéma 2. Différents outils de calcul ont été utilisés pour prédire Trois des quatre calculs utilisés prédisent T2 comme forme tautomère préférée, ce qui est cohérent avec notre hypothèse de liaison pour le composé 4. Une preuve supplémentaire est fournie par une structure de rayons X monocristalline du composé 4, qui existe également comme le tautomère T2 prédit (Figure ​ (Figure 33) .Figure 3X structure du rayon 4 du composé 4, qui est compatible avec nos deux hypothèses et calculs computationnels.Structure Topsomer 2Proposed liaison du triazole, T2, est également le minimum mondial calculé Énergie (L’Exception étant le Calcul de l’OPLS2005) Les puissances des autres bioisostères d’amide sont montrées dans le Schéma 3. Les Composés 4 – 6 présentent d’excellentes puissances, tandis que les Composés 7 et 8 ne le sont pas, est à nouveau compatible avec notre modèle de liaison donneur / accepteur de liaison H. Les composés 4 et 6 sont capables de réaliser les interactions accepteur / donneur de liaison H avec les résidus d’enzymes Tyr et Asp précités, respectivement, mais les composés 7 et 8 ne le sont pas. Le Composé 4 se différencie davantage des composés 5 et 6 en raison de sa stabilité métabolique accrue avec un taux d’extraction inférieur7 de 0,3 contre 0,7 pour les composés 5 et 6 (Schéma 3) .Scheme 3Amide Bioisosteric Analogues 4 – 8Avec ces inhibiteurs puissants et stables dans À la main, nous nous sommes ensuite concentrés sur l’amélioration de la sélectivité des composés contre mTOR. Les deux PI3K α et des cartes d’occupation de mTOR ont été générées, et ces cartographies suggèrent que le fragment phényle C-4 contribue partiellement à la sélectivité mTOR pour cette série de composés. Par conséquent, une bibliothèque avec un ensemble divers de groupes aryle et hétéroaryle sur la position C-4 a été conçue et synthétisée après une filtration minutieuse d’une série de composés virtuels pour optimiser une série de propriétés physicochimiques calculées, telles que le clogP, le poids moléculaire et En effet, cette banque d’aryles C-4 a généré un certain nombre de composés très puissants avec une excellente sélectivité, c’est-à-dire les composés 9 et 10 (tableau 1). Ces deux composés extrêmement puissants ont PI3K α Ki inférieur à 1 nM et mTOR Ki supérieur à 1 μ M. Il est à noter que le composé 9 a une sélectivité de plus de 7000 fois par rapport à la kinase mTOR. De plus, ces deux composés ont également une excellente sélectivité sur 40 autres kinases, et aucune inhibition majeure du CYP n’a été observée. Moins de 30% d’inhibition a été observée dans les enzymes 1A2, 2C9, 2D6 et 3A4 CYP à 3 μ M. Selon les cartes d’occupation de PI3K α et mTOR représenté sur la figure 4,4, le groupe phényle C-4 2,4-disubstitué hors plan se heurte à une région de la protéine mTOR qui est définie par l’Ile-78, Leu-26, Lys-28 et résidus de Pro-10.Cependant, il n’y a pas de telles interactions stériques défavorables dans la région correspondante dans les enzymes PI3K (Figure 4, 4, plus petite structure montrée sur la droite) .Pour différentes isoformes PI3K, ces composés ont une puissance à peu près égale contre PI3K &#x003b4 ; et environ 10 – 40 × moins puissant contre PI3K γ .Figure 4 Gauche: protéine mTOR marquée en orange et PI3K α étiquetée en bleu clair avec la surface indiquée. Le dichlorophényle du composé 9 tombe sur la région de carte d’occupation de mTOR définie par Ile-78, Leu-26, Lys-28 et Pro-10. 10 avec des données ADME biologiques et in vitroLa synthèse générale des thiophènes et en particulier du composé 4 est décrite dans le schéma 4 ci-dessous La synthèse a commencé avec le composé A connu, qui a été préparé selon une procédure de brevet.8 L’éther thio-méthylique A était soumis à l’oxydation de m-CPBA pour donner un mélange de sulfone et s l’ulfoxyde B, qui a ensuite été traité avec de la morpholine pour donner le composé C avec un rendement de 77%. Le composé C a été couplé à l’acide 4-chlorophénylboronique dans des conditions de Suzuki optimisées pour donner le composé D, qui a été hydrolyse dans des conditions basiques pour donner l’acide carboxylique libre E avec un rendement élevé. Le composé E a ensuite été converti en l’amide 2 via le chlorure d’acide dans des conditions standard. Finalement, le composé 2 a été traité avec du DMF et du DMA à température élevée pour donner l’intermédiaire ylure d’amide, qui a réagi directement avec l’hydrazine au triazole 4 souhaité avec un rendement de 70% sur les deux dernières étapes.9Schéma 4Synthèse du composé 4De cette série, composé 9 a été sélectionné pour des études ultérieures en raison de l’équilibre favorable de sa puissance, de sa sélectivité et de ses propriétés physicochimiques. Des études sur le métabolisme des médicaments ont suggéré que ce composé n’aurait aucun problème avec les métabolites conjugués ou actifs. Chez les rats porteurs d’une canulation de la voie biliaire, moins de 1% du médicament parent a été excrété sous forme inchangée dans l’urine et la bile. A partir de ces données, nous avons décidé d’utiliser HLM pour les prédictions pharmacocinétiques chez l’homme car les principales voies métaboliques sont clairement les transformations oxydatives. Le Composé 9 a des prédictions PK pharmacocinétiques favorables avec une faible clairance, de longues demi-vies et une excellente biodisponibilité (Tableau 2). Tableau 2: Prédictions PK du Composé 9 Basé sur HLMCompound 9 a été testé dans différentes lignées cellulaires pour sa sensibilité dans le test de viabilité cellulaire MTT. . Fait intéressant, cet inhibiteur sélectif de PI3K est plus sensible aux lignées cellulaires NSCLC (cancer du poumon non cellulaire) qui hébergent des mutations de PI3KCA que les lignées cellulaires avec la délétion PTEN, comme le montre le tableau 3. Inhibiteur sélectif de la PI3K, composé 9, est plus actif dans les NSCLCs Portant la mutation PI3KCA que d’autres lignes de cellules cancéreusesEn raison d’une meilleure PK de rongeur, le composé 10 a été administré par voie orale dans notre modèle antitumoral in vivo, les tumeurs de xénogreffe NCI-H1975 pilotées par PI3K.10 Comme le montre la figure ​ activité inhibitrice de la croissance tumorale sensible à la dose de 25 à 200 mg / kg en dosage oral QD. Dans la figure 6,6, les concentrations libres du composé 10 à 50 et 200 mg ont de bonnes expositions pour couvrir la cellule IC50 (80 nM). Il n’y a pas eu de réduction du poids corporel dans ces études in vivo comme le montre la courbe de réponse du composé 10 dans les études H1975 TGI. Figure 6: Concentrations libres du composé 10 dans les études H1975 TGI.Figure 7 Poids corporel modification du composé 10 dans les études H1975 TGI.En résumé, l’optimisation de plomb guidé par la structure a été appliquée à un hit HTS pour nous permettre de découvrir rapidement des inhibiteurs de PI3K extrêmement puissants et sélectifs avec de nouvelles structures de thiophène. Des composés actifs par voie orale avec des prédictions pharmacocinétiques humaines favorables ont également été identifiés dans cette série. Plus de détails concernant l’optimisation et le développement de ces composés seront divulgués en temps voulu.